Mécanismes cellulaires impliqués dans la résistance à l'immunothérapie anti-lymphocytes B au cours de la leucémie lymphoïde chronique

Cellular mechanisms involved in resistance to immunotherapy in B cell chronic lymphocyclic leukemia

• Auteur / Autrice : Mariam Hammadi
• Direction : Jacques-Olivier Pers
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie et santé
• Date : Soutenance en 2011
• Etablissement(s) : Brest

Mots clés

Mots clés contrôlés

Résistance aux médicaments

Leucémie lymphoïde chronique

Immunothérapie

Résumé

La leucémie lymphoïde chronique (LLC) est la plus fréquente des leucémies et se caractérise par l’accumulation de lymphocytes B (LB) CD5+ matures. Elle demeure incurable malgré l’utilisation de la chimiothérapie et de la biothérapie, comme l’utilisation des anticorps monoclonaux (Acm) anti-CD20. Les anticorps anti-CD20 ont été classés en deux types type I, tel que le rituximab (RTX) et type II tel que le tositumomab (B1). Comme les effets des Acm anti-CD20 dans le traitement de la LLC se sont révélés moins efficaces que ceux observés dans les lymphomes, l’objectif de ce travail est de mieux comprendre la physiopathologie de la LLC afin d’optimiser l’activité du RTX mais également celle du BI. Dans un premier temps, nous nous sommes intéressés au Bi et avons trouvé que cet anticorps n’induit l’apoptose que de 50% des patients atteints de LLC. Une anomalie des lipides constituant la membrane plasmique est observée chez ces patients dits résistants au Bi. Il est ainsi noté une diminution du ganglioside Ml (GM1) et de la sphingomyéline (5M) sur le feuillet externe de la membrane plasmique des LB de ces patients générant une absence de co-localisation du CD20 avec ces lipides et un défaut de recrutement de Cbp/PAG, protéine impliquée dans l’apoptose. Nous démontrons qu’il existe une anomalie de transport de la SM à la surface cellulaire. Les pompes P-gp responsables de ce transport sont moins exprimées chez les patients résistants au Bi, leur activité étant également moindre. En traitant les LB des patients résistants au Bi par la rifampicine, un activateur des P-gp, nous réussissons à restaurer la quantité de la 5M à la surface de ces LB, permettant par la suite de re-colocaliser le CD20 avec la 5M, de recruter Cbp/PAG et d’autres protéines impliquées dans le signal d’apoptose (Lyn et Syk). Ainsi, nous améliorons l’efficacité du Bi chez les patients résistants en les rendant sensibles. Dans un deuxième temps, la faible densité du CD20 pouvant expliquer l’échec de l’efficacité du RTX, nous avons voulu augmenter l’expression de sa cible par différents agents et ainsi amplifier son activité dépendante du complément (CDC). Parmi les agents étudiés, seul le CpG-ODN s’est montré efficace dans la régulation positive de l’expression de CD20 avec un temps d’incubation minimal de 48h et une concentration de iopg/ml. Enfin, nous mettons en évidence une meilleure lyse cellulaire induite par le RTX après stimulation des LB par le CpG-ODN. Cependant il n’existe pas une réelle corrélation entre le nombre de molécules CD20 et l’activité du RTX. Aussi, d’autres mécanismes de résistance existent dont la sialylation de la membrane plasmique. Celle-ci a été examinée chez les patients souffrant de LLC et plus précisément la quantité des acides sialiques en position a2-3 et a2-6 présents à la surface de leurs LB en les comparant à celle de témoins sains. L’activité de la a2-6 sialyltransferase (ST6) est également analysée. Nous démontrons qu’à la dose physiologique de 10 µg/ml de RTX, la majorité des LB de LLC résistent à la CDC induite par le RTX. En effet, seuls 20% des patients sont sensibles. Nous trouvons que les LB des patients résistants au RTX sont globalement plus sialylés en a2-6 avec une activité de la ST6 plus forte que les LB des patients sensibles au RTX et des témoins sains. Cette efficacité du RTX par CDC est améliorée en désialylant les LB de LLC par la neuraminidase. En conclusion, ces résultats permettent donc d’envisager de nouvelles stratégies thérapeutiques pour le traitement de la LLC.

Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is the most common leukemia and is characterized by the accumulation of mature B lymphocytes (LB) CD5 +. It remains incurable despite the use of chemotherapy and biotherapy, such as the use of monoclonal antibodies (mAbs) anti-CD20. The anti-CD20 antibodies were classified into two types: type I, such as rituximab (RTX) and type II as tositumomab (B1). Since the effects of anti-CD20 mAb in the treatment of CLL were less effective than those observed in lymphomas, the objective of this work is to better understand the pathophysiology of CLL in order to optimize the activity of the RTX but also that of B1. Initially, we were interested in the BI and found that this antibody induces apoptosis by only 50% of patients with CLL. An anomaly of the lipids constituting the plasma membrane is observed in patients resistant to the B1. It is thus noted a decrease in ganglioside Ml (GM1) and sphingomyelin (SM) on the outer leaflet of the plasma membrane of these patients generating a lack of co-localization of CD20 with these lipids and a lack of recruitment Cbp / PAG, a protein involved in apoptosis. We show that there is a malfunction of transporting the SM to the cell surface. P-gp Pumps responsible for this transport are less expressed in patients resistant to Bi and their activity is also reduced. By treating patients resistant to B1 by rifampicin, an activator of P-gp, we manage to restore the amount of SM on the surface of the LB, allowing subsequent re-colocalisation of CD20 with the SM and the recruitement of Cbp/PAG and other proteins involved in apoptosis signal (Lyn and Syk). Thus, we improve the efficiency of B1-resistant patients by making them sensitive. In a second step, the low density of CD20 may explain the failure of the efficacy of RTX, we wanted to increase the expression of its target by different agents and thus increase its complement dependent (CDC) activity. Among the studied agents, only CpG-ODN was effective in the up regulation of CD20 expression with a minimum incubation time of 48 hours and a concentration of 10µg/ml. Finally, we show better cell lysis induced by RTX after stimulation of B cells by CpG-ODN. However, there is no real correlation between the number of CD20 molecules anti the activity of RTX. Other resistance mechanisms exist which sialylation of the plasma membrane. This was examined in patients with CLL anti more precisely the amount of sialic acids in position a2-3 and a2-6 on the surface of their B cells in comparison to that of healthy controls. The activity of the sialyl a2-6 (ST6) was also analyzed. We demonstrate that using a physiological dose of RTX, 10 micrograms / ml, B cells of the majority of CLL resist to CDC induced by this drug. Indeed, only 20% of patients are sensitive. We find that B cells patients resistant to RTX are generally more.