Etude des modifications post-traductionnelles des histones : l’analyse structuro-fonctionnelle d'une peptidyl-prolyl isomérase et la production semi-synthétique d’une protéine acétylée

Study of histone post-translational modification : structure-function analysis of a peptidyl-prolyl isomerase and a semi-synthetic production of an acetylated protein

• Auteur / Autrice : Yoan Monneau
• Direction : Cameron Mackereth
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences, technologie, santé. Biochimie
• Date : Soutenance le 12/12/2011
• Etablissement(s) : Bordeaux 2
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences de la vie et de la santé (Talence, Gironde ; 1993-....)
• Jury : Président / Présidente : Jean Chaudiere
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Bruno Kieffer, Georges Czaplicki

Mots clés

Mots clés contrôlés

Protéines -- Modifications posttraductionnelles

Histones

Mots clés libres

Histone

Modification post-traductionnelle

Semi-synthétique

Hiolysine

S-(2-aminoéthyl)-cystéine

Acétylation

Peptidyl-prolyl isomérase

Fpr4p

FKBP

Oligopeptide

RMN

Histone

Post-translational modification

Semi-synthetic

Thiolysine

S-(2-aminoethyl)-cystein

Acetylation

Peptidyl-prolyl isomerase

Fpr4p

FKBP

Oligopeptide

NMR

Résumé

L'unité structurale de la chromatine, nommée nucléosome, est composée d'un double brin d'ADN enroulé autour d'un octamère d'histone, et subit une pléthore de modifications post-traductionnelles. Les conséquences biologiques de l’acétylation des lysines et de l’isomérisation des liaisons peptidyl-prolyl ont été étudiées à travers une analyse à l’échelle atomique par RMN de systèmes d'intérêt reconstitués in vitro. Les liaisons peptidyl-prolyl du domaine N-terminal de l'histone H3 sont substrats in vitro d’une isomérase chez S. cerevisiae nommée Fpr4p, laquelle exerce un contrôle catalyse-dépendant de la transcription. La résolution de la structure du domaine catalytique de Fpr4p, à partir de contraintes géométriques mesurées par RMN, révéla un domaine canonique de la famille FKBP (FK506-binding protein). Grâce à l'analyse de la séquence primaire et aux expériences RMN, nous proposons un modèle structural préliminaire de Fpr4p entière. L'analyse fonctionnelle est réalisée grâce à trois décapeptides construits à partir de la séquence primaire de H3 chez S. cerevisiae. Ils sont tous substrats de Fpr4p et la catalyse est équivalente pour Pro16 et Pro30. La proportion à l'équilibre du conformère cis fut déterminée pour les trois peptides et celle-ci n'est pas affectée par l'activité catalytique de Fpr4p. Les structures en solution des substrats en conformation trans ont été résolues par spectroscopie RMN, et seront utilisées pour des appariements moléculaires in silico sur le domaine catalytique de Fpr4p. Pour étudier le rôle biologique de l'acétylation des histones, une méthodologie de production de protéines acétylées a été développée. Le protocole repose sur la mutation d'une lysine en cystéine d'une protéine recombinante, suivie d'une alkylation contrôlée exploitant la nucléophilie du groupe thiol préalablement introduit. La production de l'agent alkylant adéquat est simple, rapide, réalisable dans un laboratoire de biologie et permet différents marquages isotopiques du groupe acétyle. L'alkylation d'une protéine repliée fut réalisée avec succès en conditions natives. Le dimère d'histone H2A-H2B, un intermédiaire de l'assemblage du nucléosome et siège d'acétylation in vivo, fut reconstruit in vitro. Les déplacements chimiques des domaines N et C-terminaux de H2A sont cohérents avec un état intrinsèquement déstructuré bien que leurs dynamiques moléculaires ne soient pas équivalentes.

The structural unit of chromatin, the nucleosome, is composed of double-stranded DNA wrapped around a histone octamer and is subject to a plethora of post-translational modifications. The biological consequences of peptidyl-prolyl isomerization and lysine acetylation were investigated at atomic scale through analysis of in vitro reconstituted systems by NMR. Peptidyl-prolyl bonds of histone H3 N-terminal domain are substrates in vitro of an isomerase from S. cerevisiae named Fpr4p, which underlies transcriptional control dependent on its catalytic activity. The solution structure of the catalytic domain of Fpr4p was calculated based on restraints from NMR spectroscopy, and reveals a canonical catalytic domain belonging to the FK506-binding protein (FKBP) family. Based on primary sequence analysis and NMR experiments, a preliminary structural model of full length Fpr4p is also presented. Functional analyses were performed with three decapeptides designed from the primary sequence from the N-terminal tail of S. cerevisiae histone H3. All three constitute substrates of Fpr4p, with equivalent catalysis observed for Pro16 and Pro30. The equilibrium proportion of the cis-proline conformer has been determined for all three decapeptides, and these populations are unaffected by Fpr4p catalytic activity. Structural ensembles of the substrates with proline in the trans conformation were determined by using NMR spectroscopy, and will be subsequently used for in silico molecular docking onto Fpr4p. To study a second form of histone regulation, a semi-synthetic method to produce acetylated protein was developed. The protocol relies on the site-specific mutation of lysine to cysteine in recombinant proteins followed by controlled alkylation thanks to nucleophilicity of the introduced thiol. The production of the required alkylation reagent is easy, quick, and suitable for biology laboratory and allows diverse isotopic labeling within the acetyl group. Alkylation of folded proteins has also been achieved in native conditions. As one target of acetylation in vivo, the histone H2A-H2B dimer is an intermediate of nucleosome assembly and was reconstituted in vitro. Chemical shift values of the N- and C-terminal domains of H2A are in agreement with an intrinsically disordered state although they display differences in dynamic mobility.