Détection de l’ADN par spectrométrie de diffusion Raman exaltée de surface couplée à la microfluidique

DNA detection by surface enhanced Raman spectroscopy coupled with microfluidic

• Auteur / Autrice : Enora Prado
• Direction : Laurent Servant, Sophie Lecomte
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Chimie-physique
• Date : Soutenance le 10/11/2011
• Etablissement(s) : Bordeaux 1
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale des sciences chimiques (Talence, Gironde ; 1991-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Chimie et Biologie des Membranes et des Nanoobjets (Bordeaux ; 2007-....)
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Sabine Szunerits, Annie Colin, Vincent Rodriguez
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Isabelle Daniel, Mahmoud Ghomi

Mots clés

Mots clés contrôlés

Acides nucléiques

Microfluidique

Spectroscopie Raman

Mots clés libres

Spectrométrie de diffusion Raman exaltée de surface

Microfluidique

Microfluidique à écoulement monophasique

Microfluidique à génération de gouttes

Détection d’ARN sans marquage

Adn

Arn

Acides nucléiques

Surface enhanced Raman Scattering

Microfluidic

Single-phase microfluidic

Droplet generation microfluidic

Label-free detection

Dna

Rna

Nucleic acid

Résumé

Ce travail présente une méthode originale de détection et de quantification, sans étape de marquage, de la proportion de bases libres contenues dans des acides nucléiques. La spectrométrie de diffusion Raman exaltée de surface (DRES ou SERS en anglais) nous a permis d’obtenir la signature spectrale spécifique des nucléotides caractéristiques des ARN (adénosine, cytosine, guanosine et uridine), en utilisant des colloïdes d’argent comme substrat-DRES et des ajouts de MgCl2 comme agent d’agrégation. Les conditions de détection ont été optimisées pour établir un protocole de quantification de la proportion des nucléobases non-appariées par spectrométrie DRES. Les limites de détection obtenues sont de l’ordre de quelques dizaines de picomoles. L’amélioration de la reproductibilité des mesures par spectrométrie DRES passe par le contrôle précis des temps de réaction (adsorption et agrégation), qui peut être contrôlé grâce à l’utilisation de plateformes microfluidiques adaptées. Nous avons mis en œuvre deux types de plateformes microfluidiques, l’une basée sur des écoulements monophasiques et l’autre sur la génération de gouttes. Les espèces à analyser sont contenus dans les gouttes, permettant la détection in situ par spectrométrie DRES des divers nucléotides.

This work deals with the development of an original label-free method for free bases proportions detection and quantification of nucleic acids. The surface enhanced Raman spectroscopy (SERS) allowed obtaining the specific spectral signature of characteristic nucleotides of RNA (adenosine, cytosine, guanosine and uridine), using silver colloids as SERS substrate and MgCl2 addition as aggregating agent. Then, the condition detection have optimizing to establish a label-free quantification protocol of free nucleobases proportion by SERS spectroscopy. The detection limits obtained are order of few picomoles. The reproducibility improvement of SERS detection requires the precise control of time reaction (adsorption and aggregation), which could be control thanks to microfluidic chips use. We have implemented two different microfluidic chips, one based on single-phase flows and one other based on droplets generation. The analyzed species are containing in droplets, allowing in situ detection by spectroscopy SERS of various nucleotides.