Sonder l'orientation de l'ordre moléculaire de rapporteurs lipidiques et de protéines MHC de classe 1, au sein de la membrane cellulaire, en utilisant l'imagerie de fluorescence résolue en polarisation

Probing molecular orientational order of lipid reporters and MHC Class I protein in cell membranes using polarization-resolved fluorescence imaging

• Auteur / Autrice : Alla Kress
• Direction : Sophie Brasselet, Patrick Ferrand
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Optique, photonique et traitement d'image
• Date : Soutenance le 29/11/2011
• Etablissement(s) : Aix-Marseille 3
• Ecole(s) doctorale(s) : École Doctorale Physique et Sciences de la Matière (Marseille)
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Pierre Bongrand, Christophe Lamaze, Didier Marguet
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Sandrine Lévêque-Fort

Mots clés

Mots clés contrôlés

Polarisation (lumière)

Fluorescence

Anisotropie

Mots clés libres

Ordre orientationnel moléculaire

Protéine de signalisation MHC Class I

Rapporteurs lipidiques

Imagerie d'anisotropie

Fluorescence

Polarisation de la lumière

Molecular orientational order

Signalling protein MHC Class I

Lipid reporters

Anisotropy imaging

Fluorescence

Light polarization

Résumé

L'organisation orientationnelle bio-moléculaire des lipides et des protéines dans la membrane plasmique constitue un facteur important dans les processus biologiques au cours desquelles les fonctions peuvent être reliées aux mécanismes d'orientation et d'organisation. Le concept de séparation transitoire des phases à l'échelle nanométrique dans les domaines ordonnés et désordonnés, aussi appelé « radeau lipidique », est maintenant largement accepté. De plus, les domaines ordonnés contiennent des protéines de signalisation, ce qui souligne l'importance des séparations de phase au cours des processus de signalisation. Dans cette thèse de doctorat, nous avons étudié l'ordre orientationnel moléculaire de la protéine de signalisation MHC Class I et de reporters lipidiques tels que di-8-ANEPPQ et DiI(C18). Nous avons étudié l'ordre orientationnel moléculaire de la protéine de signalisation MHC Class I et des reporters lipidiques par imagerie d'anisotropie de fluorescence résolue en polarisation. Nous avons observé l'influence du cytosquelette d'actine sur l'ordre orientationnel moléculaire de la protéine MHC et des reporters lipidiques dans la membrane plasmique. De plus, nous avons trouvé que l'ordre orientationnel moléculaire des reporters dépend de la morphologie cellulaire. Nous avons examiné les plis membranaires en modifiant la forme des cellules de façon mécanique ou pharmacologique.

Biomolecular orientational organization of lipids and proteins in the plasma membrane is a crucial factor in biological processes where functions can be closely related to orientation and ordering mechanisms. The concept of transient nanosized phase separations in ordered and disordered domains, called ''lipid rafts'' is now widely accepted. Furthermore, the ordered domains are enriched in signaling proteins, which highlights the crucial impact of phase separation during the signaling processes. While this field has been so far largely addressed by studying the translational diffusion behavior of membrane proteins and lipid reporters by Single Molecule Tracking (SMT) or Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS), only little is known about the orientational behavior of signaling proteins and lipid reporters in the plasma membrane. In this PhD thesis we investigated the molecular orientational order of the signaling molecule MHC Class I protein using fluorescence anisotropy imaging as well as of lipid reporter di-8-ANEPPQ using polarization-resolved fluorescence imaging. Fluorescence anisotropy imaging requires a fluorescent label rigidly attached to the system under study, able to report its orientational order behavior. Thus, MHC Class I protein has been successfully labeled in a rigid way. We analyzed the orientational order of MHC Class I protein quantitatively in the endomembrane and plasma membrane and we found that the orientational order of MHC Class I protein in both membranes depends primarily on the maturation state of the protein and its interaction with the cytoskeleton.