From enhancer transcription to initiation and elongation : a study of eukaryotic transcriptional regulation during lymphocyte development

De la transcription des enhancers à l'initiation et l'élongation : une étude de la régulation transcriptionnelle eucaryote au cours du développement lymphocytaire

• Auteur / Autrice : Frédéric Koch
• Direction : Jean-Christophe Andrau
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie, Spécialité Immunologie
• Date : Soutenance le 09/11/2011
• Etablissement(s) : Aix-Marseille 2
• Ecole(s) doctorale(s) : Ecole Doctorale Sciences de la Vie et de la Santé (Marseille)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Centre d'Immunologie Marseille-Luminy (1976-....)
• Jury : Président / Présidente : Philippe Naquet
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Jean-Christophe Andrau, Philippe Naquet, Michel Werner, Irwin Davidson, Dirk Eick
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Michel Werner, Irwin Davidson

Mots clés

Mots clés contrôlés

Épigénétique

Éléments activateurs (génétique)

Transcription génétique

Mots clés libres

Régulation transcriptionelle

Épigénétique

Developpement lymphocytaire

Enhancers

Structure chromatine

Transcription regulation

Epigenetics

Lymphocyte development

Enhancers

Chromatin structure

Résumé

La régulation transcriptionnelle des eucaryotes supérieurs est un processus hautement contrôlé du point de vue spatial et temporel lors du développement, ou en réaction à l’environnement. La transcription ciblée des gènes codant requiert l’assemblage d’un complexe de pré-initiation (PIC) aux promoteurs comprenant l’ARN Polymérase (Pol) II et les facteurs généraux de transcription (GTFs) et dépend de la médiation d’un signal par les facteurs activateurs de transcription (TFs). Les années récentes ont montré que la transition de l’initiation vers l’élongation productive de la transcription représente une étape clé de la régulation de l’expression des gènes. Ce processus est également contrôlé par la structure de la chromatine, les modifications d’histones et par la présence d’éléments cis-régulateurs tels que les ‘enhancers’ ou les ‘silencers’. Au cours de ma thèse, nous avons entrepris de décrypter les mécanismes de régulation transcriptionnelle impliqués dans les étapes du développement lymphocytaire. Nous avons essentiellement travaillé sur des thymocytes primaires murins isolés au stade de différenciation double positif (DP, CD4+/CD8+) pour lequel de nombreuses séquences de type ‘enhancers’ ont été caractérisées dans la littérature scientifique. Nous avons également utilisé des lymphocytes B humains (Raji) immortalisés pour certaines des expériences impliquant des manipulation génétiques complexes permettant l’étude de mutants du domaine carboxy-terminal (CTD) de Pol II. En couplant des approches d’analyse à l’échelle du génome au séquençage à haut-débit, nous avons établi des cartographies fines de la localisation de Pol II, des GTFs, des TFs,de modifications d’histones (ChIP-Seq) et de nucléosomes (MNase-seq) ainsi que la caractérisation de populations variées d’ARN par RNA-seq. Nos principaux résultats ont révélé (i) l’assemblage du PIC et la transcription des enhancers tissus-spécifiques, (ii) l’existence de plateforme d’initiation de la transcription (TIPs) aux enhancers et aux promoteurs tissus-spécifique, (ii) que le contenu en GC représente l’un des principaux éléments promoteurs mammifères en permettant une ouverture transcription-indépendante de la chromatine, (iv) l’importance d’une nouvelle modification post-traductionnelle du domaine CTD de Pol II pour la progression de l’enzyme en élongation et finalement (v) que la modification de l’histone H3 sur le résidu K36 methylé corrèle avec l’épissage des transcrits Pol II. Globalement, les résultats les plus important de ce manuscrit consistent dans la mise en évidence de la transcription des enhancers comme caractérisant l’expression des gènes tissus-spécifiques et dans l’importance des ilots CpG comme éléments promoteurs mammifères permettant la formation d’une structure ouverte de la chromatine.

Transcriptional regulation in higher eukaryotes resembles a tightly controlled temporal and spatial process, as exemplified during development or an organism’s response to environmental stimuli. Directed transcription requires the assembly of the preinitiation complex (PIC) at the promoter of protein-coding genes, including RNA Polymerase (Pol) II and the general transcription factors (GTFs), mediated by activating transcription factors (TFs). Several rate-limiting steps further control the progression of Pol II initiation to productive elongation of the gene. This process is further controlled by chromatin structure, histone modifications as well as cis-regulatory elements, such as enhancers or silencers. We set out to decipher some of these regulatory mechanisms during the tightly controlled process of lymphocyte development. Our work primarily made use of primary mouse thymocytes in CD4+/CD8+ double positive (DP, CD4+/CD8+) stage during T-cell development. To our advantage, many developmentally important cis-regulatory regions are well characterized in this cell population. For genetic manipulations, we made use of the Raji B-cell lymphoma cell-line. Using high throughput genome-wide approaches based on next generation sequencing (NGS), we performed both localization studies of Pol II, GTFs, TFs, histone modifying enzymes, histone modifications and nucleosomes as well as deep-sequencing of different RNA transcript populations. In summary, we find that (i) PICs assemble at tissue-specific enhancers leading to local transcription, (ii) large transcription initiation platforms (TIPs) at tissue-specific promoters and enhancers exist, which correlate with high CG-content of the DNA and transcription factor binding sites (TFBS), (iii) GC-content regulates the nucleosomal structure and initiation, including directionality, at promoters, (iv) Pol II is phosphorylated at a new residue of it C-terminal domain (CTD) in the 3’ regions of genes and (v) splicing events can influence the chromatin structure. Altogether, these results show that PIC formation at and transcription of enhancers are important for the regulation of T-cell target genes, that CpG islands represent important if not the major regulatory promoter element in mammals guiding tissue-specific gene expression and nucleosome structure, as well as novel mechanisms of Pol II elongation and the effect on chromatin structure.