Le rôle des cellulases dans les interactions entre les mycobactéries du complexe Mycobacterium tuberculosis et les amibes libres

• Auteur / Autrice : Felix Mba Medie
• Direction : Michel Drancourt, Bernard Henrissat
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Pathologie humaine
• Date : Soutenance le 19/09/2011
• Etablissement(s) : Aix-Marseille 2
• Ecole(s) doctorale(s) : Ecole Doctorale Sciences de la Vie et de la Santé (Marseille)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Unité de recherche sur les maladies infectieuses et tropicales émergentes (Marseille)
• Jury : Président / Présidente : Jean-Louis Mège
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Michel Drancourt, Bernard Henrissat, Jean-Louis Mège, Max Maurin, Jean-Louis Herrmann, Harry J. Gilbert
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Max Maurin, Jean-Louis Herrmann

Mots clés

Mots clés contrôlés

Enzymes végétales

Tuberculose latente

Amibes

Cellulose

Cellulase

Mycobacterium tuberculosis

Mycobacterium bovis

Mots clés libres

Mycobacterium tuberculosis complexe,

Cellulase

Cellulose

Amibes libres

Mycobacterium tuberculosis complex,

Cellulase

Cellulose

Free-living amoeba

Résumé

Le génome de Mycobacterium tuberculosis, l’agent causal de la tuberculose, code pour une protéine ayant la capacité de se fixer sur la cellulose (Rv1987), une cellulase potentielle (Rv1090), et une cellulase pleinement active (Rv0062). Cette observation est surprenante, car la cellulose est un composant majeur des parois des cellules végétales, tandis que M. tuberculosis est un pathogène humain sans contact connu avec des plantes. Nous avons émis l’hypothèse que ces protéines pourraient jouer un rôle dans les interactions entre les mycobactéries du complexe M. tuberculosis avec les kystes d’amibes libres, dont la paroi contient également de la cellulose. Dans notre travail de thèse, nous avons cherché par une analyse in silico la présence de ces trois gènes chez toutes les bactéries ayant un génome complètement séquencé présentes dans la base de données CAZy (accessible en ligne à l’adresse www.cazy.org). Cette étude a montré que seulement 2,5% des bactéries codent pour les trois gènes simultanément. Parmi ces bacteries, nous avons ensuite confirmé expérimentalement par PCR et séquençage la présence des gènes Rv0062, Rv1090 et Rv1987 chez les mycobactéries du complexe M. tuberculosis. Nous avons ensuite vérifié la transcription de ces trois gènes chez la souche de référence M. tuberculosis H37Rv, puis produit dans Escherichia coli des protéines de fusion Rv1090 et Rv1987 et montré qu'elles étaient capables d'hydrolyser la cellulose (Rv1090) et de s’y fixer (Rv1987). De plus, nous avons mis en place un model expérimental d’interaction entre les mycobactéries du complexe M. tuberculosis et les amibes libres dans le but de comprendre le rôle des gènes Rv0062, Rv1090 et Rv1987. Dans un premier temps nous avons montré que M. tuberculosis, Mycobacterium bovis, Mycobacterium canettii ainsi que Mycobacterium avium utilisé ici comme un controle positif étaient capables de survivre dans le cytoplasme des amibes libres telles que Acanthamoeba polyphaga. Ensuite, nous avons montré que M. tuberculosis et M. bovis mais pas M. canettii étaient capables de survivre à l’intérieur des kystes d’amibes. Enfin nous avons montré que M. tuberculosis, M. bovis et M. canettii étaient capables de survivre dans le sol pendant au moins 6 mois. Les données établies dans cette thèse soutiennent le rôle des cellulases dans la survie environnementale des mycobactéries du complexe M. tuberculosis, et ouvrent la voie à l’étude de cette phase méconnue dans le cycle de ces organismes

The genome of Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis, encodes a protein with the ability to bind to cellulose (Rv1987), one potential cellulase (Rv1090), and one fully active cellulase (Rv0062). This observation is puzzling, because cellulose is a major component of plant cell walls, whereas M. tuberculosis is a human pathogen without known contact with plants. We hypothesized that these genes could play a role in the interactions between M. tuberculosis complex organisms and amoebal cysts, whose wall contains cellulose.In our thesis work, we have searched by in silico analysis for the presence of these three genes in all bacteria with complete sequenced genomes present in the CAZy database (available online at www.cazy. org). This study showed that only 2.5% of bacteria encode the three genes simultaneously. Among these bacteria we have confirmed experimentally by PCR and sequencing the presence of Rv0062, Rv1090 and Rv1987 in the M. tuberculosis complex organisms. We have checked the transcript of the three genes in the reference strain M. tuberculosis H37Rv and we subsequently produced Rv1090 and Rv1987 fusion proteins in Escherichia coli and demonstrated that they were indeed able to hydrolyze (Rv1090) and to bind (Rv1987) cellulose. In addition, we have developed an experimental model of interaction between M. tuberculosis organisms and the free-living amoebae in order to understand the role of Rv0062, Rv1090 and Rv1987 genes. Initially we have shown that M. tuberculosis, Mycobacterium bovis, Mycobacterium canettii and Mycobacterium avium used here as a positive control were able to survive in the cytoplasm of the free-living amoeba such as Acanthamoeba polyphaga. We have further shown that M. tuberculosis and M. bovis but not M. canettii were able to survive within the amoebal cysts. Finally we have shown that M. tuberculosis, M. bovis and M. canettii were able to survive in soil for at least 6 months. The data obtained in this thesis support the role of cellulase in the survival of M. tuberculosis complex organisms in the environment and pave the way for the study of this unknown phase in the cycle of these organisms.