Caractérisation moléculaire d'inversions péri- et paracentriques et analyse de leurs effets sur la méiose d'individus porteurs hétérozygotes

Molecular caracterisation of peri- and paracentric inversions and analyses of their effects on meiosis of heterozygous carriers

• Auteur / Autrice : Katia Julian
• Direction : Alain Ducos, Alain Pinton
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Génétique cellulaire
• Date : Soutenance en 2010
• Etablissement(s) : Toulouse 3

Mots clés

Mots clés contrôlés

Hybridation in situ en fluorescence

Génétique

Porc

Méiose

Mots clés libres

Méiose

Immunocytologie

Inversion

Fertilité

Porc

Fish

Résumé

Les inversions sont des anomalies chromosomiques de structure résultant d'une double cassure sur un même chromosome et d'un retournement à 180° du segment chromosomique ainsi généré. Ces inversions sont dites péricentriques si les points de cassure sont localisés de part et d'autre du centromère, ou paracentriques dans le cas contraire. Chez l'Homme, la fréquence estimée des inversions péricentriques est de 0. 012% à 0. 07% et de 0,01% à 0,05% pour les inversions paracentriques (McKinlay-Gardner et Sutherland, 2004). Les porteurs hétérozygotes ne présentent généralement pas d'altération phénotypique mais sont susceptibles de rencontrer des problèmes de reproduction en raison de perturbations du processus méiotique conduisant à des troubles de la spermatogenèse et/ou à la production de gamètes génétiquement déséquilibrés. De nombreuses inversions ont été identifiées chez l'Homme et dans les espèces animales d'élevage. Cependant, peu d'études de ségrégation méiotique d'inversions ont été publiées à ce jour chez l'Homme (par exemple Morel et al. 2007), et aucune dans les espèces animales d'élevage. L'analyse méiotique de différentes inversions identifiées chez le porc dans le cadre du programme national de contrôle chromosomique mis en œuvre par notre laboratoire présente un double intérêt. Le premier est zootechnique. En effet, lors de la mise en évidence d'une inversion chez un futur reproducteur, sa réforme était jusqu'à présent systématiquement conseillée aux éleveurs. Toutefois, l'application de ce principe peut s'avérer difficile et/ou non optimal car elle peut conduire à l'élimination d'individus par ailleurs génétiquement intéressants et ainsi induire une baisse de l'efficacité des programmes de sélection. Raisonner l'utilisation des reproducteurs sur la base d'une prédiction de l'effet potentiel des remaniements nous semble une alternative raisonnable. L'un des objectifs de la Thèse est donc la mise au point et l'évaluation d'une méthode de prédiction basée sur l'estimation du pourcentage de gamètes déséquilibrés dans des échantillons de semence. Le second objectif est cognitif. En effet, des difficultés d'ordre technique et/ou éthique rendent difficile l'acquisition de certaines connaissances concernant le comportement méiotique de remaniements chromosomiques chez l'Homme. C'est le cas par exemple de l'effet du sexe du parent porteur sur le comportement et les produits de la méiose en présence d'une inversion. Le recours à un modèle animal (le porc en l'occurrence, dont la structure chromosomique est proche de celle de l'Homme) permet de s'affranchir de certaines contraintes, et d'apporter de nouvelles connaissances dans des domaines non encore documentés. Un autre objectif de la Thèse est, dans cet esprit, de réaliser une étude comparée des ségrégations méiotiques '' mâle '' et '' femelle '' d'une même inversion et ainsi de déterminer l'influence du sexe du porteur sur les effets de l'anomalie. L'analyse des profils de ségrégation méiotique '' mâle '' a été réalisée par la méthode de SpermFISH (hybridation in situ en fluorescence sur noyaux de spermatozoïdes décondensés). Les ségrégations méiotiques femelles ont pour leur part été étudiées par analyse de métaphases II d'ovocytes de truies maturés in vitro. Dans les deux cas, des sondes moléculaires de type BAC ont été utilisées. Les études d'appariement méiotique ont été réalisées à partir de biopsies testiculaires réalisées chez un verrat porteur d'une inversion péricentrique du chromosome 4. Ces échantillons ont été analysés par des méthodes d'immunocytologie à l'aide d'anticorps permettant de détecter spécifiquement certaines protéines. Les études de ségrégation méiotique de 7 inversions de tailles et de types différents ont été réalisées : les pourcentages de gamètes génétiquement déséquilibrés variaient de 0,6% à 4%, suggérant que ces inversions ont un impact très limité sur la reproduction. De manière surprenante, la proportion de gamètes anormaux produits n'est pas corrélée avec la taille du fragment inversé, comme cela est le cas chez l'Homme. La comparaison des profils de ségrégation '' mâle '' et '' femelle '' pour une inversion du chromosome 4 n'a pas non plus montré de différence de production de gamètes déséquilibrés entre les deux genres (4% et 3,6% respectivement). Le sexe du porteur ne semble donc pas être un facteur déterminant pour la production de gamètes anormaux. L'analyse des phases précoces de la méiose pour un animal porteur de la même inversion péricentrique du chromosome 4 à montré un comportement méiotique particulier du bivalent: plus de 90% des cellules montraient en effet un appariement non homologue de la région inversée. De plus, des évènements de crossing over dans la région inversée du chromosome 4 n'ont été observés que dans 5% des cas. Le comportement des chromosomes est responsable de la faible recombinaison dans la région inversée et donc de la faible proportion de gamètes génétiquement déséquilibrés estimée (4% en moyenne). Ces résultats demandent néanmoins à être confirmés par d'autres analyses. L'étude en cours des phases précoces de la méiose chez deux porteurs d'inversions péricentriques du chromosome 8 devraient nous permettre très prochainement d'approfondir nos connaissances sur le comportement méiotique des chromosomes en présence d'inversion. Par ailleurs, la mise au point de nouvelles techniques au sein du laboratoire, telles que la production de cellules souches induites (iPS) porcines, nous permet aussi d'envisager à moyen terme l'étude de l'intégralité du processus méiotique mâle en présence d'une inversion.

Inversions are structural chromosomal rearrangements formed when a chromosome breaks in two places and the fragments reverses orientation. The inversion is pericentric if the breaks occur on either side of the centromere, paracentric in other cases. Prevalence estimates in human population range from 0. 012% to 0. 07% for pericentrics and from 0,01% to 0,05% for paracentrics (McKinlay-Gardner et Sutherland, 2004). Usually, both para- and pericentric inversions are phenotypically harmless, but the presence of an inversion can occasionally lead to severe reproductive disorders due to spermatogenesis impairements and the production of genetically unbalanced gametes. Many cases of inversions have been described in humans as well as in other animal species. However, relatively few studies have reported meiotic segregation pattern analyses of inversions in males (for example Morel et al. 2007), and none were reported on domestic animals. Meiotic analyses of various inversions identified in the pig species, thanks to the national program of chromosomic control, have a double interest. The first is zootechnical. When an inversion is detected in a boar, the breeders are always advised to sacrifice the animal. However, it can be difficult to eliminate individuals with a high genetic value and then induce a lowering in the efficiency of selection programms. Using a prediction of the potential effects of rearrangements to advise the breeders seem to be a good alternative. One of the thesis purpose is then to create a predictive method based on the percentage of unbalanced gametes in semen samples. The second interest is more linked to basic research. Indeed, it can be difficult to acquire knowledge on meiotic behaviour of chromosomal rearrangements in Man due to technical and/or ethical reasons. For example, little is known on an '' sex '' effect on meitoic behaviour during meiosis for inversion carriers. The use of an animal model (like the pig species) is a great opportunity to analyze the meiotic behaviour of chromosomes in inversion carriers, and then to have a better understanding on not well documented domains. That is why an other purpose of this thesis was to carried a comparative study of meotic segregations in males and females carriers of the same anomaly, and then determine a potential '' sex '' effect. Meotic segregation pattern analyses were carried out using the SpermFISH technique (fluorescent in situ hybridization on decondensed sperm nuclei) for males, and FISH on metaphase II oocytes matured in vitro for females. In both cases, molecular probes (Bacterial Artificial Chromosome) were used. Studies of pairing behaviour were carried out on testicular samples of an inversion of chromosome 4 carrier, using immunocytological techniques (use of specific antibodies against proteins of interest). Meotic segregation pattern analyses were carried out for 7 inversions (different length of the inverted fragment and different type) : percentage of unbalanced gametes ranged from 0,6% to 4%, suggesting a limited impact on reproduction. Surprisingly, the length of the inverted fragment is not correlated to the proportion of unbalanced gametes (unlike in Man). Comparison of '' male '' and '' female '' segregation profiles for an inversion of chromosome 4 did not show either any difference concerning the production of unbalanced gametes (4% and 3,6% respectively). The gender of the carriers do not seem to be a major factor for the production of unbalanced gametes. Analyses of early stages of meiosis for a carrier of the same pericentric inversion showed a specific meiotic behaviour of the bivalent : a non homologous pairing of the inverted region was seen in more than 90% of the cells analysed. Moreover, crossing overs in the inverted region were relatively rare (5 % of the cells). This chromosomal behaviour explains the low recombination rate in the inverted region, and then the low proportion of unbalanced gametes produced (mean of 4%). These results have to be confirmed by other analyses. Studies of the early stages of meiosis in two carriers of pericentric inversions of chromosome 8 should allow in the future a better understanding of the meiotic behaviour for inversion carriers. Moreover, the use of new techniques, such as production of induced pluripotent stem cells (iPS), could allow, in the future, analyses of the whole male meiotic process in inversion carriers.