Caractérisation de Msp1, un acteur de la dynamique mitochondriale, chez la levure à fission

Characterization of Msp1 p an actor of the mitochodriale dynamics in fission yeast S. Pombe

• Auteur / Autrice : Farnoosh Khosrobakhsh
• Direction : Pascale Belenguer
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Gènes, cellules et développement
• Date : Soutenance en 2010
• Etablissement(s) : Toulouse 3

Mots clés

Mots clés contrôlés

Mitochondriopathies

Mots clés libres

Mitochondrie

Dynamique mitochondriale

S. Pombe

Levure

Msp1p

Mgm1p

Opa1

Résumé

Notre équipe s'intéresse à la dynamique mitochondriale, qui contrôle la forme des mitochondries et régule leurs principales fonctions, et dont l'altération provoque des pathologies neurodégénératives. Ce processus correspond à l'établissement d'un équilibre dynamique entre des forces de fusion et de fission des mitochondries. Quand la force de fission est prépondérante les mitochondries apparaissent sous formes de dots isolés les uns des autres. À l'inverse si la force de fusion prédomine les mitochondries apparaissent sous la forme d'un réseau de filaments plus ou moins longs et interconnectés. Récemment, de nombreuses protéines qui contrôlent la dynamique mitochondriale ont été identifiées. Dans notre équipe il a été isolé puis caractérisé l'une d'entre elle, Msp1 chez la levure à fission et OPA1 son homologue humain. Msp1/OPA1 contrôle la fusion des mitochondries et la mort des cellules. Les mutations de OPA1 provoquent une atrophie optique dominante de type 1, qui touche le nerf optique et peut conduire à la cécité. Le sujet de thèse qui m'a été confié concerne l'isolement et la caractérisation de partenaires génétiques de Msp1. Pour cela un préalable était requis : disposer d'un mutant thermosensible de la dynamine. Au cours de la première moitié de ma thèse, j'ai construit un mutant thermosensible de Msp1 porteur d'une mutation du domaine GTPase (P300S) par recombinaison homologue. J'ai ensuite caractérisé ce mutant et recherché des conditions de létalité induites par l’inactivation de Msp1. J'ai montré que cette souche est affectée dans la morphologie de ses mitochondries, sa respiration et présente une sensibilité accrue au stress oxydatif. J'ai également montré que cette souche est incapable de proliférer en milieu galactose ce qui m'a permis de mettre au point un crible génétique visant à isoler des suppresseurs multicopies de la létalité induite par l'inactivation de Msp1. En parallèle à ces travaux, j'ai contribué à l'étude des mécanismes de protéolyse de Msp1p. Msp1p existe chez la levure sous deux isoformes : une forme longue (l-msp1) issue du clivage par la peptidase mitochondriale lors de l'import de la dynamine et une forme courte (s-msp1p) dont la formation était inconnue. A l'aide de mutants de différents protéases mitochondriales que nous avons construits, nous avons montré que la protéase Rhomboïde 1 est impliquée dans la formation de s-msp1p, et que la m-AAA protéase, Paraplégine, contrôle la stabilité de la forme l-msp1p. Nous avons également utilisé ces mutants pour caractériser les mécanismes de protéolyse des huit variants d'épissage d'OPA1, que nous avons surexprimés chez ces levures. Pour la plupart des variants d'épissage, la m-AAA protéase, contrairement aux protéases Yme1p et Rhomboïde 1, est impliquée dans le clivage de la dynamine, permettant de revisiter certains résultats contradictoires parus dans la littérature. Mes travaux de thèse pourraient déboucher sur une meilleure compréhension du rôle de Msp1 et permettre d'identifier de nouveaux acteurs et régulateurs de la dynamique mitochondriale qui pourraient constituer de nouveaux gènes candidats pour des pathologies mitochondriales.

Mitochondrial dynamics is a regulated interplay between antagonistic fission and fusion forces acting on mitochondrial membranes. This process determines mitochondrial morphology; when fission or fusion predominates, mitochondria appear as isolated dots or as a filamentous and interconnected network, respectively. Proteins that control the morphology of mitochondria have been identified. Our team has isolated and characterized Msp1p in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe, and its human orthologue OPA1, which control mitochondrial fusion. Furthermore we have found that mutations in the OPA1 gene are associated with the most frequent form of autosomal dominant optic atrophy that features a progressive loss of retinal ganglion cells, often leading to blindness. Understanding the function of the dynamin Msp1p requires identification of its partners, which was part of my thesis. To perform a genetic screen for msp1+ interactors, I generated a thermosensitive (ts) mutant of msp1+ (Msp1P300S) by homology to a ts substitution described at a position conserved in other dynamins. The mutation was integrated at the msp1+ locus by homologous recombination. I then characterized this mutant to search for conditions of lethality. At restrictive temperature, the mutant had fragmented mitochondria when grown on respiratory, glucose-containing medium, and further showed altered respiration and increased ROS production on non-fermentable ethanol/glycerol-containing medium. Perturbation of colony pigmentation in ade6 background, which relates to mitochondrial dysfunctions, and lethality on non-fermentable galactose-containing media, were also observed. As a perspective, we plan to take advantage of this latter property to screen a cDNA library for the presence of multicopy suppressors of thermolethality. In addition to this work, we have studied the mechanisms of maturation of Msp1p, which is processed into a long and a short isoform (l- and s-Msp1p) during its biogenesis. Using mutants of various mitochondrial proteases, we demonstrated that the two isoforms of Msp1p are independently formed from the same precursor and that generation of s-Msp1p implicates Rhomboid 1. Furthermore, we showed that the m-AAA protease Paraplegin might control the stability of l-Msp1p. These proteases mutants were also used to study the proteolysis of the eight OPA1 splicing variants heterologously expressed in S. Pombe. Most of these variants were only processed by Paraplegin, a finding that could allow to precise contradictory results obtained in mammals where Yme1p and Rhomboid 1 were implicated in the maturation of OPA1. Together, my thesis works will allow to better understand the mode of action of Msp1 in mitochondrial functions and to identify new actors and regulators of mitochondrial dynamics possibly implicated in orphan mitochondrial pathologies.