Etude génétique et biochimique de la P15, le suppresseur de RNA silencing du Peanut clamp virus

Genetic and biochemical study of P15, the RNA silencing suppressor of Peanut clump virus

• Auteur / Autrice : Santiago Wadsworth
• Direction : Olivier Voinnet
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie cellulaire et moléculaire des plantes
• Date : Soutenance en 2010
• Etablissement(s) : Strasbourg

Mots clés

Mots clés contrôlés

ARN polymérases

ARN bicaténaire

Immunoprécipitation

Résumé

Le RNA silencing est un mécanisme de régulation négative de l’expression des gènes, retrouvé chez la plupart des organismes eucaryotes et basé sur des interactions d’ARN séquence-spécifiques. Il est déclenché par de l’ARN double brin qui est découpé par Dicer en de petits ARNs de 21 ‡ 24nt, nommés short-interfering (si)RNAs ou microRNAs. Un brin du duplex est incorporé dans un complexe appelé RNA-induced silencing complex (RISC), pour guider le clivage endonucléolytique ou l’inhibition traductionnelle d’ARNm présentant une homologie de séquence. Chez les plantes, le RNA silencing joue un rôle important dans la défense antivirale, le développement et l’adaptation aux stress biotiques et abiotiques. Pour contrer ce mécanisme de défense, les virus de plantes ont élaboré des protéines dites suppresseurs de RNA silencing. Au cours de cette thèse, nous avons analysé les interactions entre le RNA silencing et le Peanut clump virus (PCV). Nous avons démontré que les siRNA dérivés de PCV sont produits par Dicer-like 4 (DCL4) et dans une moindre mesure par DCL2, se traduisant par l’accumulation de siRNA de 21 et 22nt respectivement. La P15, suppresseur de RNA silencing du PCV, provoque une réduction drastique des niveaux de siRNA provenant des molécules d’ARN exogène de type tige-boucle ; et stabilise le brin non incorporé dans RISC. Dans une deuxième partie, nous avons étudié les interactions de P15 et ces protéines cibles. Nous avons ainsi identifié DCL1 parmi les protéines co-immunoprécipitées par P15 et montré que P15 affecte le niveau d’accumulation de DCL1, suggèrant ainsi que P15 pourrait déclencher une régulation négative DCL1-dépendante du système antiviral.

RNA silencing refers to a set of RNA-based eukaryotic processes that regulate gene expression in a sequence-specific manner. It initiates with the processing of dsRNA by Dicer (RNase type III) proteins into small molecules of dsRNA of 21- to 24-nt in length, generally referred as short-interfering (si)RNAs or microRNAs, depending on their origin. One brand of the small duplex is incorporated into an effector complex, the RNA-Induced Silencing Complex, to guide the regulation of gene expression through different mechanisms, including endonucleolytic cleavage, translational repression or histone- and DNA-modifications. In plants, siRNAs and miRNAs are involved in viral defense, development and adaptation to biotic and abiotic stresses. As natural targets of RNA silencing, plant viruses have produced highly diverse proteins called silencing suppressors. First, we have studied the genetic requirements of Peanut clump virus (PCV) viral-si(vs)RNA production in Arabidopsis and shown that PCV RNA is primary processed by Dicer-like 4 (DCL4) to produce 21-nt vsRNAs, with DCL2 playing a minor role in the production of 22-nt PCV viRNAs. We also observed that P15, the PCV-encoded silencing suppressor, drastically reduces the accumulation of siRNAs derived only from transgenic hairpins of perfect dsRNA and stabilizes the non-incorporated brand of the miRNA duplex. Another part of this work consisted in the identification of plant proteins that may interact with P15. Among others, we identified DCL1 as P15 co-immunoprecipitated protein and showed that P15 alters the level of DCL1, suggesting that P15 may mediate a DCL1-dependent negative regulation of the antiviral plant defense.