Microscopie multiphotonique de protéines fibrillaires : application à l’étude de la fibrose hépatique

Multiphoton microscopy of fibrillar protein : application to the study of liver fibrosis

• Auteur / Autrice : Thomas Guilbert
• Direction : Yann Le Grand, Christophe Odin
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Physique
• Date : Soutenance en 2010
• Etablissement(s) : Rennes 1
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences de la matière (Rennes1996-2016)
• Partenaire(s) de recherche : Autre partenaire : Université européenne de Bretagne (2007-2016)

Mots clés

Mots clés contrôlés

Tissu conjonctif -- Maladies

Collagène

Optique non linéaire

Processus à plusieurs photons

Microscopie

Résumé

Les techniques d'imagerie optique basées sur des effets non linéaires sont de plus en plus appliquées en biologie. La microscopie multiphotonique fournit une information micrométrique avec une profondeur d'imagerie inégalée dans les tissus vivants, tout en les préservant des effets phototoxiques. Les différentes sources de contrastes endogènes des tissus biologiques permettent de visualiser sans marquage l'émission de fluorescence excitée à deux photons (TPEF), et la génération de seconde harmonique (SHG) de molécules non centrosymétriques dans un milieu non centrosymétrique, en particulier certaines protéines fibrillaires. Ces contrastes permettent des applications dans des domaines comme l'embryologie, les neurosciences ou encore la cancérologie. La microscopie multiphotonique apparaît donc comme un outil bien adapté à l'étude des protéines fibrillaires. Nous présentons dans un premier temps la technique de microscopie multiphotonique, les deux contrastes mis en jeu, ainsi qu'un outil reposant sur la modulation de polarisation de la lumière excitatrice pour la caractérisation du collagène et de la myosine. Nous présentons également une étude préliminaire sur l’imagerie du muscle squelettique bovin. Dans un second temps, nous utilisons la spécificité de la SHG pour le collagène pour développer une méthode de ''quantification'' du collagène impliqué dans la fibrose du foie. Après une analyse détaillée de notre méthode de scoring SHG, elle est évaluée et comparée aux méthodes usuelles de caractérisation de la fibrose. Cette méthode basée sur l'utilisation d'objectifs à faible NA, pourrait être utilisée en endoscopie SHG, quand les biopsies virtuelles seront possibles.

Optical imaging techniques based on nonlinear effects of photon-matter interactions, are increasingly applied in biology. Multiphoton microscopy provides an in-depth information at a micrometric scale in tissues, with low photo-toxicity. Moreover, the various sources of endogenous contrast in biological tissues allow to visualize, without any staining, the two photon excited fluorescence emission (TPEF), and second harmonic generation (SHG) of non-centrosymmetric molecules in non-centrosymmetric media, such as fibrillar proteins like collagen and myosin. These two endogenous contrasts enable a wide range of applications along with embryology, neuroscience or oncology. In this context, multiphoton microscopy appears as a promising tool for the study of fibrillar proteins present in biological tissues. In this document we first present the basis of multiphoton microscopy, the two contrasts involved in this imaging technique, and a tool based on the modulation of polarization of the exciting laser for the characterization of two fibrillar proteins, collagen and myosin. We also present a preliminary study of cattle skeletal muscle by multiphoton microscopy. In a second step, we use the specificity of SHG for imaging collagen to develop a method of scoring of fibrillar collagen deposits in human liver fibrosis. After an in-depth study of our collagen SHG scoring method, it is evaluated and compared to usual technics used to characterise fibrosis. This method which uses low NA lenses, could be extended to SHG endoscopes, when virtual biopsies will be possible.