Formulations liposomales innovantes d'inhibiteurs d'histone desacétylases et d'hydroxytamoxifène : ciblage in vivo de tumeurs mammaires et de myélome multiple

New liposomal formulations encapsulating histone deacetylases inhibitors or 4-hydroxytamoxifen : in vivo targeting of breast cancer and multiple myeloma

• Auteur / Autrice : Giorgia Urbinati
• Direction : Jack-Michel Renoir
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Pharmacotechnie Biopharmacie
• Date : Soutenance en 2010
• Etablissement(s) : Paris 11
• Partenaire(s) de recherche : Autre partenaire : Université de Paris-Sud. Faculté de pharmacie (Châtenay-Malabry, Hauts-de-Seine)

Mots clés

Mots clés contrôlés

Inhibiteurs

Histones

Liposomes

Cancer du sein

Mots clés libres

Myélome multiple

Résumé

Les histones desacétylases (HDAC) régulent l’expression et l’activité de nombreuses protéines impliquées dans la prolifération de cellules tumorales. Ces enzymes peuvent donc être considérés comme une nouvelle cible d’une thérapie anti-cancéreuse. Les inhibiteurs d’HDAC (HDACi) sont capables de bloquer la prolifération cellulaire, d’induire l’apoptose et montrent une activité très importante vis-à-vis de plusieurs lignées cancéreuses, cependant ces molécules sont peu spécifiques et peuvent causer des importants effets secondaires. Il est donc nécessaire d’envisager un système de délivrance capable de promouvoir une accumulation préférentielle dans la tumeur tout en préservant les tissus sains. Pour cette étude, trois HDACi ont été encapsulés dans une formulation liposomale : le CG 1521, le PXD 101 et la trichostatine A (TSA). En absence de leur encapsulation dans des liposomes, les trois principes actifs sont peu solubles et la TSA est rapidement métabolisée in vivo en perdant ainsi son activité pharmacologique. L’encapsulation de ces molécules dans des liposomes a permis leur administration par voie intraveineuse en préservant les molécules d’un métabolisme trop rapide. En effet, l’utilisation de formulations liposomales chargées en CG 1521, PXD 101 et TSA montre in vitro une activité anti-cancéreuse importante et les liposomes de TSA ont montré de surcroît, une action inhibitrice de la croissance tumorale sur des xénogreffes de cancer du sein à cellules MCF-7 et MDA MB 231. Les analyses d’immunohistochimie révèlent une inhibition de la croissance tumorale due à une diminution du marqueur de prolifération cellulaire, le Ki67, une diminution de la vascularisation tumorale (CD34) et une augmentation de l’expression du suppresseur de tumeurs p21. L’expression du récepteur des œstrogènes (ERα) est également inhibée et une augmentation de l’expression du probable suppresseur de tumeurs RhoB peut être observé dans les tumeurs MCF-7. Ces résultats montrent l’intérêt d’utiliser la TSA sous forme liposomale pour le traitement de cancers hormono-dépendants et –indépendants. De façon corrélée, ce projet de thèse a vu également la mise au point d’une nouvelle formulation liposomale contenant le 4-hydroxytamoxifène (4HT), l’anti-œstrogène de référence pour le traitement des cancers du sein hormono-dépendants, pour le traitement du myélome multiple. La préparation de ce système nanoparticulaire est basée sur l’utilisation de la technique de gradient de pH avec un pH externe de 9 et un pH interne de 5. 1. Les liposomes ainsi obtenus révèlent un taux d’encapsulation de la molécule intérêt de l’ordre d’1 mM, une stabilité satisfaisante et la capacité à retenir le principe actif pendant une durée augmentée par rapport aux liposomes classiques. L’activité anti-tumorale de ces liposomes chargés en 4HT a été mesurée sur différentes lignées cellulaires de myélome multiple ainsi que sur des xénogreffes issus de cellules RPMI 8226, Lp1K et Lp1 D1b. Les résultats montrent un arrêt complet de la croissance tumorale et cela est confirmé par des analyses d’immunohistochimie qui indiquent une diminution de Ki67 et de CD34 concomitante à une augmentation de l’apoptose au sein de la tumeur révélée par l’augmentation du clivage de la caspase-3. L’utilisation de liposomes chargés en 4HT pourrait être envisagé en tant que nouvelle stratégie thérapeutique pour le traitement non seulement du cancer du sein mais aussi du myélome multiple.

Histone deacetylases (HDACs) regulate the expression and the activity of numerous proteins involved in cancer cell progression, thus they are a promising novel class of anticancer drug targets. HDAC inhibitors (HDACi) are able to block cell proliferation, induce apoptosis and show a strong activity against several cancer diseases, but these compounds act unselectively causing a wide range of side effects. Hence, a delivery system mediating specific accumulation in tumor tissue is needed. CG1521 is in the final stage of pre-clinical trials, PXD101 (Belinostat®) is in Phase II clinical trials, and Trichostatin A (TSA) is the most potent HDACi in vitro. All molecules have low water solubility, and TSA loses its activity when i. V. Injected in vivo. Our new approach for their intravenous administration use liposomes that protect them from fast metabolism. The three HDACi were encapsulated and TSA-Stealth® liposomes efficiently inhibited cell proliferation and enhanced apoptosis in breast cancer cell lines as compared to free inhibitor. The antitumor activity of liposomal TSA was measured in two xenograft models of human breast cancers (BC). In both MCF-7 and MDA-MB-231 BC tumors, liposomal TSA resulted in tumor progression arrest. Immunohistochemical staining revealed a strong diminution of Ki67 and of the vasculature marker CD34, as well as an enhanced expression of the cdk inhibitor p21WAF1/Cip1 in both tumors. ERα expression was strongly diminished concomitantly with an increase of tumor suppressor Rho-B in MCF-7 BC tumors. All together these data support the usefulness of TSA-liposomes for the treatment of both hormone-dependent and -independent BC. Meanwhile, a liposomal formulation incorporating the 4-hydroxy-tamoxifen (OHT) has been developed. Several pegylated liposomes were formulated by varying the composition of lipids, increasing external pH from 7. 4 to 9. 0 and doubling the lipid concentration. Dipalmitoylphosphatidylcholine / cholesterol / distearoylphospho-ethanolamine-poly (ethylene)glycol liposomes (DL-9 liposomes) were chosen for their physico-chemical properties. Compared to conventional non-pH-gradient liposomes, OHT-DL-9 liposomes resulted in concentration of up to 1 mM 4HT, greater stability, relative toxicity and slow OHT release. Toxicity and release kinetics were assessed in breast cancer MCF-7 as well as in multiple myeloma (MM) cells. In vivo antitumor activity and bio-distribution were measured in the RPMI8226, LP1K and LP1 D1b MM models. Intravenous injections of OHT-DL-9 liposomes at 4mg/kg/week blocked MM tumor growth. Ki67 and CD34 labeling decreased in treated tumors, concomitantly with increase of activated caspase-3 supporting a cell proliferation arrest, a decrease of tumor vasculature and the induction of tumor cell death. This antitumor effect was assumed to be the result of a modified biodistribution of OHT once trapped in DL-9 liposomes. Such OHT-containing pH-gradient stealth® nanocarriers could be helpful not only for hormone-dependent breast cancer but also for MM treatment.