Optimisation des dérivés triphénylamines pour le marquage d'ADN : de l'étude des propriétés de fluorescence à deux photons à l'analyse structurale de brins d'ADN

Optimization of triphenylamine derivatives for DNA labeling : from the study of their two-photon fluorescence properties to the structural analysis of DNA

• Auteur / Autrice : Germain Metgé
• Direction : Marie-Paule Teulade-Fichou
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences biologiques. Biophotonique
• Date : Soutenance en 2010
• Etablissement(s) : Paris 11
• Partenaire(s) de recherche : autre partenaire : Université de Paris-Sud. Faculté des sciences d'Orsay (Essonne)

Mots clés

Mots clés contrôlés

Microscopie de fluorescence

Mots clés libres

Fluorescence par absorption de deux photons

Marquage de l'ADN

Marqueur de petit sillon

Durée de vie de fluorescence

Stm

Résumé

Les performances de la microscopie biphotonique sont fortement corrélées au développement de marqueurs fluorescents spécifiques. Dans le cadre d'un précédent travail, les dérivés Triphénylamines (TP) substitués par des groupements cationiques vynilpyridinium, se sont révélés être des candidats particulièrement intéressants : bonne solubilité dans l'eau, taille réduite, photostabilité élevée, forte brillance moléculaire (σ2p Φf), exaltation de fluorescence en présence d'ADN, émission dans le rouge (λem 660-680nm). . . L'objectif du travail présenté a consisté à la fois à mieux comprendre l'origine de ces propriétés assez rarement réunies et à explorer les voies d'optimisation potentielles. Dans ce but, nous avons mis en place un banc de microscopie de fluorescence à deux photons résolue en temps. Celui-ci va nous a permis de faire des analyses conjointes d'intensité et de durée de vie de fluorescence du signal émis. Différents dérivés ont été étudiés de façon à établir des corrélations entre leurs structures et leurs propriétés. De même, différents environnements ont été considérés (tampon, ADN naturel et de synthèse). Nous avons pu mettre en évidence que les dérivés TP interagissent spécifiquement avec l'ADN, vraisemblablement via une insertion dans le petit sillon du double brin d'ADN. Cette insertion entraine une très forte restriction des mouvements intramoléculaires et par suite une réduction des voies de relaxation non-radiatives. Une augmentation du taux de relaxation radiative a également pu être mise en évidence, l'insertion du fluorophore dans le petit sillon de l'ADN entrainant en effet également un changement d'environnement du fluorophore (passage d'un environnement aqueux propice à des effets dits de « quenching » à un environnement organique). Afin de pouvoir caractériser ces interactions fluorophore-ADN à l'échelle nanométrique, des études complémentaires de microscopie à effet tunnel (STM) sous UHV ont également été entreprises sur ces dérivés. Nous avons par ailleurs essayé de tirer parti des interactions spécifiques TP-ADN pour immobiliser l'ADN sur des substrats d'or atomiquement plans.

Due to the rather poor properties of two-photon induced fluorescence (TPIF) emission of most endogenous biological substances, the performances of two-photon induced microscopy are strongly correlated to the development of specific fluorescent labels. Ln the frame of a previous work, vinyl-pyridinium substituted triphenylamines dyes (TP) have been shown to exhibit particularly interesting properties: good water solubility, small size, high photostability, high molecular brightness (σ2p Φf), fluorescence intensity enhancement in the presence of DNA, red emission (λem =660-680nm). . . Altogether such properties happen to be rarely met: the aim of the work presented here was to get a better understanding of the origin of such performances together with investigating potential optimization routes. Towards this objective, we have developed a specific time resolved two-photon fluorescent microscopy set-up enabling to analyze simultaneously both the fluorescence intensity and the lifetime of the emitted fluorescence signal. Various derivatives have been studied in order to establish structure-properties relationships. Similarly, different environments have been considered (buffer solution, natural and synthetic DNA). We could demonstrate that TP derivatives specifically interact with DNA, presumably via insertion into the minor groove of double stranded DNA. This insertion causes a very strong restriction of intramolecular motions and consequently a marked reduction of the dyes non-radiative relaxation rates. An increase of the TP dyes radiative relaxation rate was also evidenced, the dye insertion in the DNA minor groove causing indeed also a change in the fluorophore environment (experiencing a change from an aqueous environment leading to quenching, to an organic environment). Ln order to get complementary nanoscale characterization of TP dyes-DNA interactions, we have performed further scanning tunnelling microscopy studies at the UHV -solid interface. We have moreover tried to take advantage of the specific TP-DNA interactions to immobilize DNA onto atomically flat gold substrates.