Study of the regulation of the kinase complexes AtSnRK1 ("SNF1-Related Protein Kinase 1") of Arabidopsis thaliana

Etude de la régulation des complexes kinases AtSnRK1 ("SNF1-Related Protein kinase 1") chez arabidopsis thaliana

• Auteur / Autrice : Pierre Crozet
• Direction : Martine Thomas, Jean Vidal
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences biologiques
• Date : Soutenance en 2010
• Etablissement(s) : Paris 11
• Partenaire(s) de recherche : autre partenaire : Université de Paris-Sud. Faculté des sciences d'Orsay (Essonne)

Mots clés

Mots clés contrôlés

Métabolisme -- Régulation

Phosphotransférases

Arabidopsis thaliana

Résumé

La famille de protéines kinases SNF1/AMPK/SnRK1 exhibe une forte conservation aussi bien de structure que de fonction. Ces complexes hétérotrimériques sont considérés comme des régulateurs centraux du métabolisme, permettant son adaptation au cours de différents stress. Ce travail a été divisé en trois parties, toutes concernant la régulation des complexes SnRK1 (« SNF1 Related protein Kinase 1 ») d’Arabidopsis thaliana. Dans un premier temps, l’utilisation de protéines recombinantes a permis de montrer que les deux kinases en amont de SnRK1, les AtSnAKs (« A. Thaliana SnRK1 Activating Kinases »), sont autophosphorylées ; ce processus menant à leur activation précède un mécanisme moléculaire de phosphorylations croisées entre AtSnRK1alpha et les AtSnAKs, qui a aussi été décrypté. Ce dernier implique une rétro-phosphorylation qui pourrait participer à une régulation homéostatique de ce système in vivo. Puis le travail a consisté en l’étude de la régulation métabolique de complexes AtSnRK1 purifiés. Une méthode inédite de chromatographie d’immuno-affinité, nous a permis de purifier rapidement des complexes AtSnRK1 natifs et ainsi de faciliter la recherche de régulateurs métaboliques de SnRK1, à l’instar de son homologue animal, l’AMPK. Alors que l’AMPK est activée par l’AMP, nous avons mis en évidence un effet inhibiteur inattendu des adénylates in vitro. Ces kinases sont également inhibées par d’autres métabolites comme le nitrate, certains acides aminés et le citrate. Enfin, le même type d’approche a été réalisé sur les kinases amont AtSnAKs. Comme pour AtSnRK1, une forte inhibition par les adénylates in vitro a été trouvée ainsi que par d’autres métabolites comme le NAD.

The SNF1/AMPK/SnRK1 protein kinase family exhibits a eukaryote-wide conserved structure and function. Indeed, they are heterotrimeric complexes, now considered as global regulators of metabolism, allowing its adaptation to various stresses. This work is divided in three parts, all related to the upstream regulation of Arabidopsis thaliana SnRK1 (SNF1 Related protein Kinase 1). Firstly, by using recombinant proteins technology, it was found that the upstream kinases, AtSnAKs (A. Thaliana SnRK1 Activating Kinases), were autophosphorylated and that this process leads to their activation. It precedes a molecular mechanism of cross-phosphorylation between AtSnRK1alpha and its upstream kinases, AtSnAK, that was also elucidated. This mechanism includes an inhibitory feedback phosphorylation controlling AtSnAK that we believe might participate to the homeostatic control of SnRK1 activation in vivo. Then this work was dedicated to the study of the modulation of purified SnRK1 activity by metabolites. By using an immuno-affinity chromatography, we are now able to quickly purify A. Thaliana SnRK1 complexes. This method allowed us to check whether they were regulated through metabolites like its mammalian homologue, the AMPK. We found very surprising results concerning the modulation by adenylates which appear to down-regulate the complex activity in vitro in an opposite way compare to mammalian AMPK. The complexes are also inhibited by other metabolites such as nitrate, amino-acids or citrate. Finally, the same kind of approach was performed on the AtSnAK proteins. It was found that they are also strongly inhibited by adenylates in vitro, but also by other metabolites such as NAD.