Utilisation de modèles murins pour l'étude du rôle physiologique des isoformes de BRaf et du rôle des protéines Raf dans le lignage mélanocytaire

Use of mouse models to study the physiological roles of BRaf isoforms and the role of the Raf proteins in the melanocyte lineage

• Auteur / Autrice : Agathe Valluet
• Direction : Alain Eychène
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Bases fondamentales de l'oncogénèse
• Date : Soutenance en 2010
• Etablissement(s) : Paris 7

Mots clés

Mots clés contrôlés

Mélanocytes

Souris

Régulation de l'expression des gènes

Mitogen-Activated Protein Kinase Kinases

Épissage alternatif

Protéines proto-oncogènes B-raf

Résumé

Le laboratoire s'intéresse à la voie de signalisation ERK, particulièrement aux protéines Raf (ARaf, BRaf et I CRaf). Nous avons montré que le gène BRAF codait de multiples isofbrmes présentant une expression tissu-j spécifique. La présence des séquences codées par les exons 8b/9b module les propriétés biochimiques et I oncogéniques de BRaf Mon projet de recherche a consisté à analyser le phénotype de souris knockout dans | lesquelles chacun des exons a été invalidé. Les résultats ont montré que l'épissage alternatif n'est pas essentiel pour I le développement ni pour la myélination du cerveau. Des analyses comportementales ont mis en évidence que l'expression des isoformes contenant l'exon 9b, et pas celles contenant l'exon 8b, était requise pour les mécanismes de mémoire et d'apprentissage dépendants de l'hippocampe. Le gène BRAF est muté dans 50% des mélanomes cutanés. Mon deuxième projet de thèse a consisté à générer et analyser le phénotype de souris mutées pour BRaf et CRaf dans les mélanocytes. Les souris ne présentent pas de défaut de pigmentation à la naissance, BRaf et CRaf ne sont donc pas requis pour l'homéostasie des mélanoblastes (MB). Cependant, les souris développent un phénotype de blanchiment du poil causé par une perte des cellules souches mélanocytaires (MSC). Les protéines Raf sont donc impliquées dans l'autorenouvellement des MSC, indépendantes de la signalisation en aval de Kit, tandis que les MB sont dépendants de cette signalisation et ne présentent pas de défaut particulier dans nos souris. Ces observations révèlent un découplage imprévu entre les signalisations Kit et ERK dans les cellules mélanocytaires.

Our team works on the ERK pathway and we mainly focus on the Raf proteins family. We have demonstrated that the BRAF gene encoded several isoforms resulting from alternative splicing of exons 8b and 9b. The presence of these sequences modulates the biochemical and oncogenic properties of the protein. The aim of my project was to analyse the phenotype of knockout mice for each £/to/alternatively spliced exons. Constitutive ablation revealed no obvious defects during embryogenesis and adulthood. However, behavioural analyses revealed a specific role for exon 9b-containing BRaf isoforms in certain types of hippocampal-dependent learning and memory. BRaf and CRaf protein kinases have recently emerged as critical players in cutaneous melanoma but little is known about their putative role in the melanocyte lineage in vivo. The aim of my second project was to analyse the phenotype of mice deleted for both BRaf and CRaf in this lineage. Surprisingly, the double knockouts displayed normal pigmentation at birth and did not show signifîcant defect in melanoblasts. However, fbllowing the first hair | molting, the double knockout animals unveiled a progressive hair graying phenotype resulting from depletion of j melanocyte stem cells (MSC). In vitro cultures of melanocytic cells derived from knockout animals could not sustain growth in the presence of TPA but proliferated in the presence of the Kit ligand, SCF. Taken together, our results show that Raf signalling is required for proper MSC maintenance, but dispensable for early melanocyte lineage development. Our observations reveal an unexpected uncoupling between Kit and Raf signalling in the melanocyte lineage.