Perturbation de la maturation des ARN pré-messagers : biologie et applications thérapeutiques

Alteration of pre-mRNA maturation : biology and therapeutic applications

• Auteur / Autrice : Agathe Eckenfelder
• Direction : Olivier Danos, Luis Garcia
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Structure, fonction et ingéniérie des protéines
• Date : Soutenance en 2010
• Etablissement(s) : Paris 7

Mots clés

Mots clés contrôlés

Lentivirus

Vecteurs génétiques

Exons

Épissage des ARN

Thérapie génétique

Myopathie de Duchenne

Résumé

La dystrophie de Duchenne est causée par des mutations du gène codant la dystrophine perturbant souvent le cadre de lecture. L'exclusion d'un exon est possible et mène à la production d'une protéine plus courte mais fonctionnelle. Pour induire un saut d'exon, des séquences antisens ciblant des sites d'épissage du pré-ARNm sont utilisées. Ces séquences peuvent être véhiculées par des snRNA tels que U7 ou Ul qui augmentent leur stabilité, et délivrées en vecteurs viraux pour obtenir une correction à long terme. Nos travaux récents ont démontré que des vecteurs AAV et lentiviraux délivrent efficacement des séquences antisens pour induire un saut d'exon dans le muscle de souris, de chien ou dans des cellules de patients. Ce travail a mené à un essai clinique aujourd'hui en préparation mais se heurte au problème des doses importantes de vecteur à administrer. Plusieurs modifications peuvent être envisagées pour réduire la dose de vecteur, dont une optimisation des niveaux d'expression de UTsnRNA. Nous avons modifié deux cassettes, U7DTex23 et U7ex51AONlongl utilisées pour induire les sauts de l'exon 23 du pré-ARNm dystrophine murin ou de l'exon 51 du pré-ARNm dystrophine humain respectivement. Des cassettes U7 dans lesquelles un activateur muscle-spécifique a été introduit ou basées sur les éléments transcriptionnels de U6 ou 7SK dépendant de la RNAPIII, ont été produites en vecteurs lentiviraux ou AAV2/1. Elles ont été testées dans des myoblastes humains ou par injection intramusculaire de souris mdx. Les résultats montrent que le changement de promoteur ne permet pas d'exprimer U7 alors que l'ajout de l'activateur semble augmenter l'expression de U7 et le saut d'exon.

Duchenne muscular dystrophy is caused by mutations in the dystrophin gene that mostly disrupt the mRNA reading frame. Artificial exclusion of an exon is possible to restore the reading frame, giving rise to a shorter but functional protein. To induce exon skipping, antisense sequences directed against splice sites of pre-mRNA are used. These sequences can be attached to small nuclear RNAs, such as U7 or Ul improving their stability, and then be delivered usmg viral vectors to achieve long term correction. Our recent work has demonstrated that AAV and lentiviral vectors efficiently deliver antisense sequences for exon skipping in the skeletal muscle of mice, dogs, and in cells from Duchenne patients. This work has laid the foundation for clinical trials now in preparation but face the problem of large quantifies of vector to be administered. Several modifications can be envisaged to reduce the dose of vector including optimization of the expression levels of therapeutical U7snRNA. We modified two U7 cassettes, the U7DTex23 used for the skipping of exon 23 in the murine dystrophin pre-mRNA and the U7ex51 AONlongl spécifie of the skipping of exon 51 in the human dystrophin pre-mRNA. U7 cassettes in which a muscle specific enhancer has been added, or new cassettes based on RNAPIII transcriptional elements from the U6 or 7SK genes, have been produced. The new cassettes have been packaged into lentiviral or AAV2/1 vectors and tested in human myoblasts or following direct injection into the muscle of mdx mice respectively. The results show that the change of promoter does not allow expressing U7 whereas addition of the enhancer seems to increase U7 expression and exon skipping.