Persistance et dissémination du plasmide pB10, vecteur de gènes de résistance aux antibiotiques, dans des biomasses issues de stations d'épuration d'eaux usées urbaines

Persistence and dissemination of the pB10 plasmid , vector of antibiotics resistance genes, in bacterial biomass from urban wastewater treatment plant

• Auteur / Autrice : Sébastien Bonot
• Direction : Jean-Claude Block, Christophe Merlin
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences de la vie et de la santé
• Date : Soutenance le 02/07/2010
• Etablissement(s) : Nancy 1
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale BioSE - Biologie, Santé, Environnement
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : LCPME
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Jean-Claude Block, Christophe Merlin, Fabienne Petit, Pascal Simonet, Sophie Courtois, Pierre Leblond
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Fabienne Petit, Pascal Simonet

Mots clés

Mots clés contrôlés

PCR (génétique)

Plasmides

Eaux usées -- Stations de traitement

Résistance aux antibiotiques

Mots clés libres

Antibiotiques

Gènes de résistance

Transferts horizontaux

Stations d’épuration d’eaux usées urbaines

Sédiments de rivière

PCR quantitative

Plasmide pB10

Antibiotics

Resistance genes

Horizontal transfers

Wastewater treatment plant

River sediments

Quantitative PCR

PB10 plasmid

Résumé

L’utilisation massive des antibiotiques, depuis les années 50, génère une libération importante de ces molécules dans l’environnement (excrétion via les urines et les fèces) que l’on peut retrouver à des concentrations allant de 1 à 100 ng/L dans les eaux usées urbaines. Parce qu’elle réunit microorganismes résistants et antibiotiques, la station d’épuration d’eaux usées urbaines pourrait être une zone propice au transfert des gènes de résistance. Cependant, avec sa position stratégique à l’interface entre les activités humaines et l’environnement, la station d’épuration pourrait constituer un « rempart » contribuant à limiter leur dissémination dans l’environnement.Les paramètres qui influencent ces transferts dans les stations d’épuration sont encore mal connus, en particulier du fait de limitations méthodologiques. Aussi l’objectif de notre travail était de déterminer les facteurs environnementaux influant sur la stabilité et le transfert d’un élément génétique mobile modèle, le plasmide pB10, dans des communautés bactériennes (biomasses de stations d’épuration et sédiments de rivière) maintenues en microcosmes. Jusqu’à présent, les transferts de gènes de résistance ont été principalement étudiés avec des méthodes reposant sur la culture de microorganismes sur milieux sélectifs, dont nous savons aujourd’hui qu’elles sous-estiment les phénomènes observés. Aussi, nous avons élaboré une approche basée sur la PCR quantitative pour détecter la dissémination d’un ADN mobile modèle amené via une bactérie hôte E. coli DH5α. Les couples amorces/sondes très spécifiques ont pu être élaborés en tirant profit de la structure mosaïque du génome bactérien. L’approche proposée repose sur des mesures comparées du nombre de plasmide pB10 et de son hôte bactérien DH5α au cours du temps, où une augmentation du rapport (pB10/DH5α) implique une dissémination du plasmide vers les bactéries indigènes. Outre l’intérêt du développement méthodologique proposé, cette méthode a permis d’évaluer l’incidence de quelques paramètres environnementaux sur la dissémination d’un ADN au sein de communautés microbiennes complexes. Deux groupes de facteurs ont pu être distingués selon qu’ils influencent la persistance du plasmide pB10 dans les communautés dans son hôte initial (oxygénation/brassage, ajout d’antibiotiques en concentrations sub-inhibitrices comme l’amoxicilline et le sulfaméthoxazole fréquemment retrouvés en station d’épuration) ou/et qu’ils favorisent sa dissémination dans les communautés bactériennes (biofilms, sédiments). Sans induire de transferts génétiques, les antibiotiques testés, même en concentrations sub-létales, pourraient participer à la dissémination de gènes de résistance en favorisant leur persistance

The widespread use of antibiotics since the 50s, generates a significant release of these molecules in the environment (excretion via urine and feces) which can be found at concentrations ranging from 1-100 ng/L in wastewater. Due to the high microbial biomass and the abundance of nutrients, wastewater treatment plants (WWTP) represent a suitable habitat for horizontal gene transfer. Because they occupy a key position between human activities and the environment, WWTP may play a major role in limiting the dissemination of antibiotic resistance genes, therefore contributing to the preservation The parameters which influence these transfers in wastewater treatment plants are still poorly known, especially because of methodological limitations. Therefore the aim of our study was to identify environmental factors affecting the stability and transfer of a mobile genetic element model, the plasmid pB10 in bacterial communities (biomass from wastewater treatment plants and river sediments) maintained in microcosms. So far, the transfer of resistance genes have been studied mainly with methods based on the cultivation of microorganisms on selective media that we know now they underestimate the observed phenomena. Also, an approach based on quantitative PCR was developed for detecting the release of a mobile DNA template from the host bacterium E. coli DH5α. Couples of designed primers/probes were very specific and have been developed by taking advantage of the mosaic structure of the bacterial genome. The proposed approach is based on the over time measurements of the number of plasmids pB10 and its bacterial host DH5α, where an increased ratio (pB10/DH5α) implies a release of the plasmid to the indigenous bacteria. This method was used to assess the impact of some environmental parameters on the release of DNA in complex microbial communities. Two groups of factors could be distinguished according to whether they influence the persistence of plasmid pB10 in communities in microcosms (oxygenation / mixing, addition of antibiotics at sub-inhibitory concentrations as amoxicillin and sulfamethoxazole frequently found in treatment plant) and / or they favor his release in bacterial communities (biofilms, sediments). Without inducing genes transfers, the antibiotics tested, even at sub-lethal concentrations, could participate in the dissemination of resistance genes by facilitating their persistence