Mécanisme d'action de nouveaux agents alkylants ciblant l'ADN ou les protéines

Mecanism of action of new alkylating agents which target dna or proteins

• Auteur / Autrice : Gaëlle Lenglet
• Direction : Marie-Hélène David
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biochimie et biologie moléculaire
• Date : Soutenance le 15/12/2010
• Etablissement(s) : Lille 2
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Biologie-Santé (Lille ; 2000-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Centre de recherche Jean-Pierre Aubert

Mots clés

Mots clés contrôlés

Réparation de l'ADN

Protéines fixant l'ADN

Protéomique

Liaison aux protéines

Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenases

ADN

Dissertations académiques

Antinéoplasiques alcoylants

ADN -- Réparation

Protéines de liaison à l'ADN

Interactions ADN-protéine

Protéomique

Anticancéreux

Protéines de liaison

Glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénases

ADN

Alkylants

Mots clés libres

S23 906-1

Jlk 1486

Translocation nucléaire

Alkylating agents

Résumé

Le S23906-1 est un dérivé diacétate de la benzo-[b]-acronycine. Sélectionné pour son potentiel cytotoxique in vitro et son activité anti-tumorale in vivo, ce composé très prometteur est entré en essai clinique en 2006-2007. Cet agent alkylant présente la particularité d’interagir avec l’azote en position 2 des guanines localisé dans le petit sillon de l’ADN et d’induire ensuite une ouverture locale de la double hélice. La conformation de ce composé est importante pour son activité puisque la présence du groupement réactif acétate en orientation S induit une plus forte déstabilisation de l’ADN par rapport à l’orientation R, ceci en corrélation avec une plus forte cytotoxicité et une meilleure activité anti-tumorale. Cependant le mécanisme moléculaire mis en place, pour conduire à la mort de la cellule tumorale reste peu connu. Afin de mieux comprendre le lien entre la déstabilisation de l’ADN et l’activité cytotoxique du S23906-1, nous avons cherché à déterminer la nature des protéines nucléaires qui reconnaissent spécifiquement cette lésion. Une approche protéomique par chromatographie d’affinité suivie d’une électrophorèse séparative et d’analyse en MALDI-TOF nous a permis d’identifier la GAPDH. Des expériences de retard en gel ont validé l’interaction de la GAPDH à l’adduit S23906-1/ADN simple ou double brin. La recherche d’une éventuelle séquence consensus de fixation à l’ADN de la GAPDH a été entreprise par méthode de CASTing. Si aucun consensus proprement-dit n’est clairement apparu, une prévalence de fixation pour les séquences riches en guanines a été observée. Des études de relation structure/fonction ont montré les adduits formés par les dérivés diacétylés ou benzo-[a]-diacétylés de l’acronycine déstabilisent également l’ADN et que la GAPDH se fixe également de manière efficace à ces adduits. Par comparaison à d’autres composés interagissant au niveau de l’azote 2 des guanines, nous n’avons observé aucune interaction de la GAPDH avec l’adduit ET-743/ADN (l’ET-743 stabilise l’ADN), alors que d’autres auteurs ont mis en évidence une interaction avec l’adduit QAD/ADN, où QAD est un dérivé de la Saframycine A, molécule structurellement proche de l’ET-743. Au niveau cellulaire, un traitement au composé QAD engendre une translocation de la GAPDH du cytoplasme vers le noyau. Nous n'avons pas retrouvé une telle translocation en utilisant le S23906-1. De plus, et contrairement à ce dérivé de la Saframycine A, nos cellules traitées avec un siRNA dirigé contre la GAPDH sont plus résistantes au S23906-1, suggérant un rôle anti-apoptotique de la GAPDH suite au traitement au S23906-1, contrairement à l’effet pro-apoptotique observé avec le dérivé QAD de la Saframycine A. En parallèle, nous nous sommes intéressés à de nouveaux agents cytotoxiques, dont des composés de série benzylamine bis-8-hydroxyquinoline. En utilisant des approches spectrométriques et biochimiques, nous avons montré que le composé principal JLK1486 ne cible pas l'ADN, mais réagit de manière covalente avec des groupements thiol comme celui du glutathion. Cependant, des études cellulaires de déplétion du glutathion endogène ont montré que le glutathion n’était pas la cible du composé JLK1486 mais participait à sa détoxification. Afin d’identifier la ou les cible(s) protéique(s) responsable(s) de l’effet cytotoxique du JLK1486, nous avons mis au point une approche dérivée de l’électrophorèse 2D-DIGE.

S23906-1 is a diacetate benzo-[b] acronycine derivative. Selected for its cytotoxic potential in vitro and its antitumoral activity in vivo, this very promising compound entered clinical trial in 2006-2007. This alkylating agent presents the peculiarity to interact with the nitrogen in position 2 (N2) of guanines, localized in the minor groove of the DNA, and to subsequently lead local opening of the double helix. The conformation of this compound is important for its activity. Indeed, the presence of the active acetate group in the S-orientation leads to a stronger destabilization of the DNA with regard to the R-orientation, in correlation with a stronger cytotoxicity and a better antitumoral activity of the S- rather than R-stereoisomer. However, the molecular mechanism leading to the death of treated tumoral cell lines remains poorly understood. To address the link between the destabilization of the DNA and the cytotoxic activity of the S23906-1, we tried to determine the nature of nuclear proteins that specifically recognize this lesion. A proteomic approach, using chromatographic affinity followed by SDS-PAGE electrophoresis and MALDI-TOF analysis, identified the GAPDH protein. EMSA experiments validated the interaction of GAPDH to the S23906-1/DNA adduct (as a single- or double-stranded DNA template). The search for a possible consensus DNA-binding sequence of GAPDH was performed using a CASTing method. Even though no consensus site was clearly identified, prevalence for G-rich and GT-rich sequences was evidenced. From structure/activity relationships studies, we showed that DNA alkylation using the diacetylated or benzo-[a]-diacetylated forms of acronycine also destabilize the DNA helix and that GAPDH also binds in an efficient manner to these adducts. By comparison to other compounds also interacting with the N2 group of guanines, no interaction of the GAPDH with the ET-743/ADN adduct was evidenced (ET-743 stabilizes the DNA), while other authors evidenced an interaction with DNA of QAD, a Saframycine A derivative and a molecule structurally related to ET-743. At the cellular level, cellular treatment with the QAD resulted in GAPDH translocation from the cytoplasm to the nucleus. We did not observe such a translocation using S23906-1. Furthermore cells treated with a siRNA directed to the GAPDH are more resistant to S23906-1, suggesting an anti-apoptotic role of GAPDH after S23906-1 treatment, by contrast with the pro-apoptotic effect observed in the literature with QAD . In parallel, we were interested in new cytotoxic agents, among which abis-8-hydroxyquinoline benzylamine series. Using spectrometric and biochemical approaches, we showed that the lead compound JLK1486 does not target DNA, but covalently reacts with thiol groups as that of the glutathione. However, cellular studies using depletion of the endogenous glutathione showed that the glutathione was not the target of JLK1486 but that it participated in its detoxification as it does for S23906-1. To identify the protein(s) target(s) responsible for the cytotoxic effect of JLK1486, we developed an approach derived from the 2D-DIGE electrophoresis which clearly evidenced proteins that are the cellular targets for JLK1486.