Microfluidique digitale pour la préparation d’échantillon et l’analyse de l’expression des gènes par qRT-PCR

Digital microfluidics for sample preparation and gene expression analysis by qRT-PCR

• Auteur / Autrice : Arnaud Rival
• Direction : Xavier Gidrol, Dorothée Jary
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Physique pour les sciences du vivant
• Date : Soutenance en 2010
• Etablissement(s) : Grenoble
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale physique (Grenoble ; 1991-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratoire d'électronique et de technologie de l'information (Grenoble ; 1967-....)
• Partenaire(s) de recherche : Equipe de recherche : Laboratoire de fonctionnalisation et de chimie des microsystèmes (Grenoble)
• Jury : Président / Présidente : Franz Brückert
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Jérôme Rollin
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Patrick Tabeling, Jean-Louis Viovy

Mots clés

Mots clés contrôlés

Transcriptome

Expression génique

Microfluidique

Procédures d'analyse par micropuces

Mots clés libres

Laboratoire sur puce

Microfluidique digitale

Ewod

Préparation d'échantillon

Expression des gènes

Transcriptome

Cellule unique

Lab-on-a-chip

Digital microfluidics

Electrowetting

Ewod

Sample preparation

Gene expression

Transcriptome

Single cell

Résumé

La microfluidique digitale, et plus particulièrement l'électromouillage sur isolant (EWOD), est une méthode performante pour créer et contrôler des gouttes de quelques dizaines de nanolitres. Ces gouttes constituent des milieux réactionnels de volumes réduits, spécialement adaptes a des problématiques biologiques complexes difficiles à aborder dans des volumes plus importants. Nous avons utilisé la technologie EWOD pour développer un laboratoire sur puce dédié à l'étude de ('expression des gènes sur des échantillons biologiques de très petites tailles. Les étapes de la fabrication du microsystème, telles que les procédés concernant les couches diélectriques et hydrophobes, ont été optimisées, pour permettre un fonctionnement à 95 °C. Un banc de test a de plus été spécialement fabrique. Les opérations fluidiques nécessaires au protocole de qRT-PCR sur puce ont été caractérisées, optimisées et contrôlées. Par exemple, deux modes de mélange en goutte par convection ont été mis en évidence et étudiés en détail. Nous avons de plus démontré la possibilité d'utiliser des billes magnétiques sur la puce EWOD. Enfin, ce laboratoire sur puce a été utilise pour valider un protocole d'analyse du transcriptome de quelques cellules voire d'une cellule unique, intégrant sur la même puce ('extraction des ARN messagers et leur analyse par qRT-PCR.

Digital microfluidics, in particular electrowetting on dielectric (EWOD), is an efficient method for dispensing and manipulating nanoliters droplets. These droplets represent reaction mediums with reduced volumes, specially adapted to complex biological issues, usually difficult to handle in larger volumes. We used EWOD technology to develop a lab-on-a-chip dedicated to gene expression studies on tiny biological samples. Microsystem fabrication steps, such as processing of dielectric and hydrophobic layers, were optimized to operate at 95 °C. A specific test bench was also developed. All the necessary fluidic operations for qRT-PCR protocol were characterized, optimized and controlled. For instance, two mixing modes inside droplets were pointed out and studied in detail. Moreover, we demonstrated the ability of EWOD technology to handle magnetic beads on chip. Finally, this lab-on-a-chip was used to validate a protocol of transcriptome analysis starting from of a few cells and even a single cell, integrating messenger RNAs extraction followed their analysis by qRT-PCR on the same chip.