Etudes biophysiques et structurales du complexe de réplication des Rhabdoviridae : la phosphoprotéine et ses interactions avec la nucléoprotéine

Biophysical and structural studies of the Rhabdoviridae replication complex : the phosphoprotein and its interactions with the nucleoprotein

• Auteur / Autrice : Cédric Leyrat
• Direction : Marc Jamin
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Chimie et sciences du vivant
• Date : Soutenance en 2010
• Etablissement(s) : Grenoble
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale chimie et science du vivant (Grenoble ; 199.-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : The Unit for virus host cell interactions (Grenoble ; 2007-2016)
• Jury : Président / Présidente : Valdur Saks
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Daniel Kolakofsky
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Noël Tordo, Sonia Longhi

Mots clés

Mots clés contrôlés

Phosphoprotéines

Nucléoprotéines

Rhabdoviridés

Virologie

Mots clés libres

Nucléoprotéine

Phosphoprotéine

Rhabdoviridae

Biologie structurale

Virologie

Virology

Structural biology

Rhabdoviridae

Phosphoprotein

Nucleoprotein

Résumé

Le virus de la stomatite vésiculaire (VSV) et le virus de la rage (RV) appartiennent à la famille des Rhabdoviridae et sont les représentants prototypiques respectifs des genres Vesiculovirus et Lyssavirus. Ces virus sont enveloppés, et leur génome est composé d’une molécule d’ARN de polarité négative qui encode successivement cinq protéines virales dont la nucléoprotéine (N) et la phosphoprotéine (P), qui forment, avec l’ARN polymérase ARN dépendante virale (L), le complexe de transcription et de réplication des Rhabdoviridae. L’objectif de mon travail de thèse consistait à obtenir des informations structurales concernant la phosphoprotéine et plusieurs de ses fragments, à l’état libre en solution, ou en complexe avec N, et ce afin de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans la multiplication virale. La protéine P interagit avec N en formant deux types de complexes distincts : le complexe N-ARN-P, résultant de l’association de P avec les complexes N-ARN, qui constituent la matrice utilisée pour la transcription et la réplication virale, et le complexe N0-P, qui correspond à la fixation par P d’une molécule de nucléoprotéine N0 monomérique, empêchant ainsi la fixation non spécifique de N à l’ARN et permettant l’encapsidation des génomes et anti-génomes néo-synthétisés lors de la réplication virale. Les travaux réalisés ont permis de mettre en évidence la nature modulaire des dimères de phosphoprotéine, et de caractériser la région N-terminale intrinsèquement désordonnée de P (PNTD) impliquée dans la fixation à N0. Nous avons montré que le domaine C-terminal impliqué dans la fixation à N-ARN (PCTD) constituait un module structural indépendant, et modélisé à l’échelle atomique la structure multi-domaine partiellement désordonnée de P en solution. Nous avons également construit un modèle atomique in silico de l’interaction entre N-ARN et P, validé expérimentalement, et enfin résolus par diffraction des rayons X la structure du complexe N0-PNTD à l’état cristallin. Les travaux présentés concernant la structure de la phosphoprotéine libre ou en complexe avec la nucléoprotéine permettent de mieux comprendre le rôle de P dans le complexe de réplication, et soulignent l’importance du désordre moléculaire et des changements conformationnels dans les processus de reconnaissance moléculaire impliquant N et P. Les modèles structuraux des complexes N-ARN-P et N0-P constituent par ailleurs des nouvelles cibles intéressantes pour le développement de composés antiviraux.

Vesicular Stomatitis Virus (VSV) and Rabies Virus (RV) belong to the Rhabdoviridae family and are prototypic members of the genus Vesiculovirus and Lyssavirus, respectively. VSV and RV are envelopped, single stranded, negative sense RNA viruses, and their genome encode successively for five viral proteins including nucleoprotein (N) and phosphoprotein (P), which form, together with the viral RNA dependent RNA polymerase (L), the Rhabdoviridae transcription and replication complex. The aim of this work was to obtain structural information regarding the structure of phosphoprotein and of several of its fragments, free or in complex with N, in order to better understand the mechanisms involved in viral replication. The P protein interacts with N by forming two distinct types of complexes : the N-ARN-P complex results from the association of P with the N-RNA complex, which constitutes the active template for transcription and replication ; the N0-P complex arises from the attachment of P to a N0 molecule, thus preventing binding to non specific RNA and allowing for the specific encapsidation of newly synthesized genomes and antigenomes during viral replication. The data presented here reveals the modular organization of P dimers and highlights the intrinsically disordered character of its N-terminal region involved in N0 binding (PNTD). It is shown that the C-terminal domain of P (PCTD) is an autonomous folding unit that can bind to N-RNA complexes. The atomic scale modeling of P in solution shows that the protein behaves as a partially disordered, highly flexible multidomain protein. Additionally, we constructed a structural model of the interaction between N-RNA and P in silico, which was validated experimentally, and we solved the crystal structure of the N0-PNTD complex using X-Ray diffraction. The work presented here concerning the structure of P, free or in complex with N enhances our understanding of the role of P in the viral replication complex, and emphasizes the importance of structural disorder and conformational changes in the molecular recognition processes involving N and P. The structural models for the N-ARN-P and N0-P complexes also represent attractive new targets for the development of antiviral drugs.