Thèse soutenue

Relations structure-fonction de l'ACC oxydase et de l'anthocyanidine synthase : analogies et différences
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Auteur / Autrice : Lydie Brisson
Direction : El Hassan AjandouzAriane Jalila Simaan
Type : Thèse de doctorat
Discipline(s) : Nutrition et sécurité alimentaire. Aspects moléculaires et cellulaires
Date : Soutenance en 2010
Etablissement(s) : Aix-Marseille 3

Mots clés

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Mots clés contrôlés

Résumé

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L'anthocyanidine synthase (ANS) et l'oxydase de l'acide 1-aminocyclopropane-l-carboxylique (ACCO) sont deux oxydases à fer(ll) non-hémique, membres de la superfamille structurale des cupines. Bien que l'ACCO n'utilise pas de cofacteur 2-oxoglutarate (20G) pour son activité, elles sont toutes deux apparentées à la famille des oxygénases dépendantes du 20G. L'ACCO catalyse la production d'éthylène à partir de l'ACC et nécessite, outre le dioxygène, l'ascorbate et l'hydrogénocarbonate. L'ANS oxyde in vivo les leucoanthocyanidines en anthocyanidines et requière in vitro la présence d'ascorbate, de dioxygène et de 20G. Les deux enzymes ont été produites dans des systèmes recombinants d' E. Coli, puis purifiées. Leurs paramètres cinétiques ont été déterminés mais l'étude de l'ANS a nécessité davantage de travaux de mise au point car elle reconnaît in vitro plusieurs substrats qui aboutissent chacun à l'obtention de plusieurs produits différents. L'étude cinétique a été complétée par la modélisation moléculaire dans le but de comprendre leur mécanisme et de proposer des sites potentiels de fixation de leurs effecteurs. Plus particulièrement, les deux enzymes requièrent la présence d'ascorbate in vitro pour leur activité et nous nous sommes attachés à comprendre le rôle et le site d'interaction de ce cofacteur. Les résultats indiquent que l'hydrogénocarbonate interagit avec la Lys158, l'Arg300 de l'extrémité C-terminale et l'Arg244 ainsi que la Ser246 du motif RXS. Il interagit également avec l'ACC, favorisant ainsi sa fixation et probablement la catalyse. L'utilisation des analogues phosphonate de l'ACC confirme le modèle de fixation proposé et nous avons pu proposer un mécanisme séquentiel aléatoire pour l'ACCO, en regard de l'ACC, l'hydrogénocarbonate et l'ascorbate. Ce dernier semble se fixer à l'entrée d'un canal allant de la surface de l'enzyme vers le fer. Un tel canal est présent dans l'ANS. Les paramètres cinétiques de cette dernière ont pour la première fois été déterminés avec la dihydroquercétine comme substrat. L'ascorbate, qui se lie à l'ANS dans le canal d'accès au fer, semble nécessaire à l'activité enzymatique. L'étude de ces deux enzymes ouvre de nouvelles perspectives au sein du laboratoire, notamment l'étude plus globale de la réactivité autour du métal. Nous envisageons en effet de moduler celle-ci par mutagénèse dirigée pour aboutir à l'obtention de nouvelles activités à partir notamment de l'ANS.