Caractérisation du module de recombinaison spécifique de site du prophage KplE1 d'Escherichia coli : de l'assemblage de l'intasome à la régulation des gènes

Caracterisation of the KplE1 prophage site-specific recombination module in Escherichia coli : from intasome assembly to genetics regulation

• Auteur / Autrice : Gaël Panis
• Direction : Mireille Ansaldi, Vincent Méjean
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Microbiologie, biologie végétale et biotechnologies
• Date : Soutenance le 18/10/2010
• Etablissement(s) : Aix-Marseille 2
• Ecole(s) doctorale(s) : École Doctorale Sciences de la Vie et de la Santé (Marseille)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratoire de Microbiologie Moléculaire et Biotechnologies (Marseille)
• Jury : Président / Présidente : Frédéric Barras
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Mireille Ansaldi, Vincent Méjean, Frédéric Barras, François Cornet, Evelyne Richet, Ariane Toussaint
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : François Cornet, Evelyne Richet

Mots clés

Mots clés contrôlés

Gènes

Recombinaison génétique

Bactériophages

Escherichia coli

Mots clés libres

Bactériophage

Prophage

Recombinaison spécifique de site

Prophage excision

Intasome

Intégrase

Excisionase ou RDF

Intégrase auto-régulation

Résumé

KplE1 est l’un des dix prophages présents sur le chromosome de la souche Escherichia coli K12. Nous avons montré in vivo que ce prophage est compétant pour s’exciser du chromosome bactérien bien qu’il soit incapable de former des particules virales et de lyser son hôte. Au laboratoire, nous avons identifié les protéines IntS (intégrase) et TorI (RDF), codées sur le prophage KplE1, et la protéine IHF (NBP) de l’hôte comme seules impliquées dans le mécanisme de recombinaison spécifique de site (RSS). Nous avons cartographié sur les régions attL et attR, les sites de fixations des protéines de recombinaison permettant l’assemblage de l’intasome, le complexe nucléoprotéique compétant pour la RSS. L’ensemble de ces sites ainsi que les gènes intS et torI qui chevauchent respectivement les régions attL et attR, ont permis de définir un module de recombinaison de type KplE1. Ce module est très conservé et se retrouve chez des phages infectant différentes souches d’E. coli et de shigella. Le modèle en terme de RSS est celui décrit pour les bactériophages de type λ. Cependant, le nombre et l’organisation des sites de recombinaison suggèrent que l’architecture de l’intasome de type KplE1 diffère de celle de λ. Nos résultats renforcent ainsi l’idée que l’assemblage de l’intasome est spécifique du module de RSS considéré même si, in fine, la réaction catalysée demeure similaire.En ce qui concerne l’expression des gènes intS et torI, le fait que ces gènes soient localisés à chacune des extrémités du prophage, rend ainsi impossible leur couplage transcriptionnel à partir d’un promoteur commun au moment de la commutation lyse/lysogénie, tel qu’il est connu pour les phages lambdoïdes. De part son orientation atypique sur attL, la présence de sites de fixations des protéines IntS et TorI au niveau du promoteur du gène intS, nous ont logiquement amené à étudier sa régulation. Nous avons ainsi montré que le gène intS est négativement régulé par son propre produit ainsi que par la protéine RDF TorI. Nos résultats in vivo et in vitro indiquent que l’efficacité de la réaction de recombinaison excisive est intimement liée à la quantité d’intégrase présente, pouvant alors justifier la raison d’être de ce contrôle strict de l’expression du gène intS. En parallèle, une approche in silico a révélé que cette orientation atypique du gène codant pour l’intégrase est largement répandue sur les génomes des prophages, nous amenant à généraliser ce mécanisme atypique de régulation négative de l’intégrase.

KplE1 is one of the 10 prophage region present on the Escherichia coli K12 chromosome. We showed in vivo that this prophage is fully competent to excise from the bacterial chromosome, although it is unable to form viral particles and lyse its host. In the laboratory, we have identified Ints (integrase) and TorI (RDF) proteins, encoded on the KplE1 prophage, and the host protein IHF (NBP) only involved in the mechanism of site-specific recombination (SSR). We have mapped on attL and attR regions, the binding sites of recombinant proteins for the assembly of the intasome, the nucleoprotein complex competent for SSR. All of these sites as well as intS and torI genes that overlap respectively attL and attR regions, have permit to define a KplE1 recombination module. This module is highly conserved and is found among phages infecting different E. coli and shigella strains. The model in terms of RSS is that described for λ bacteriophage. However, the number and organization of recombination sites suggests that the architecture of the KplE1 intasome differs from that of λ. Our findings reinforce the idea that the intasome assembly is specific to the SSR module considered even if ultimately the catalyzed reaction is similar.Regarding the intS and torI gene expressions, the fact that these genes are located at each end of the prophage, prevented the transcriptional coupling of these genes from a common promoter when the lysis/lysogeny switch occurs. Because of its atypical orientation on attL, and the presence of IntS and TorI protein binding sites that overlap its promoter region, we have logically studied the regulation of the intS gene. We have shown that intS is negatively regulated by both IntS and TorI proteins. Our in vivo and in vitro results suggest that the efficiency of the excision recombination reaction is closely related to the amount of this integrase, which can justify the strict control of the intS gene expression. In parallel, an in silico approach has revealed that the atypical orientation of the integrase gene is widespread in prophage genomes, leading us to generalize this atypical mechanism of negative regulation of integrase