Nouveaux outils exploratoires et développement d'approches thérapeutiques dans les dysferlinopathies primaires

Development of novel diagnosis tools and exploration of innovative therapeutic approaches in primary dysferlinopathies

• Auteur / Autrice : Nicolas Wein
• Direction : Nicolas Lévy
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Pathologie humaine
• Date : Soutenance le 09/12/2010
• Etablissement(s) : Aix-Marseille 2
• Ecole(s) doctorale(s) : École Doctorale Sciences de la Vie et de la Santé (Marseille)
• Jury : Président / Présidente : Jamel Chelly
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Nicolas Lévy, Jamel Chelly, Jacques Beckmann, Gillian Buttler-Brown, Philippe Moullier, Michaël Sinnreich
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Jacques Beckmann, Gillian Buttler-Brown

Mots clés

Mots clés contrôlés

Sarcolemme

Myopathies distales

thérapie

Dystrophies musculaires des ceintures

génétique

Protéines du muscle

Maladies musculaires

Mots clés libres

Dysferline

Réparation membranaire

Saut d'exon

Miniprotéine

Aav

Cgh

Muscle

Dysferlinopathies

AAV gene transfer

Résumé

Les dysferlinopathies constituent un groupe de dystrophies musculaires autosomiques récessives comprenantprincipalement la myopathie des ceintures (LGMD) de type 2B et la myopathie distale de Miyoshi. Elles sont causéespar des mutations dans le gène DYSF qui se situe dans la région chromosomique 2p13.1-13.3 (NM_003494). Ce gènecomporte 55 exons répartis sur plus de 230 kb. Il est exprimé principalement dans le muscle squelettique etcardiaque, mais également dans d'autres tissus (placenta...) et types cellulaires tels que lesmonocytes/macrophages. La dysferline (2080 acides aminés, 237 kDa, O75923) fait partie de la famille des Ferlineset comporte 7 domaines C2, senseur de calcium et un domaine transmembranaire C-terminal.La dysferline participe à la formation des tubules-T et à la fusion des myoblastes en myotubes avec lamyoferline (un autre membre de la famille). Elle est localisée au sarcolemme de la fibre musculaire squelettiqueadulte, où elle joue un rôle dans sa réparation. En effet, chez l’homme comme dans les modèles murins, en absencede dysferline, des vésicules, dont la nature n’est pas clairement établie, s’accumulent sous le sarcolemme lésé sansfusionner avec celui-ci. Elle interagirait avec plusieurs protéines membranaires ou cytosoliques, dont certaines(comme la cavéoline 3) sont aussi impliquées dans d’autres formes de LGMD.Au cours de ma thèse, mon travail a été axé d’une part sur l’amélioration des techniques de diagnostic : étudede délétion/duplication dans le gène DYSF par CGH et le développement d’un test permettant d’évaluerl’absence/présence de la dysferline à partir de sang total par des techniques de FACS et d’immunofluorescence.D’autre part j’ai également étudié la pertinence d’approches thérapeutiques. Ainsi, nous avons mis en évidence unelarge délétion homozygote des ¾ du gène DYSF chez une patiente présentant un phénotype modéré dedysferlinopathies. Cette délétion permet cependant la production d’une dysferline tronquée. L’identification decette miniprotéine, la première identifiée à ce jour a permis de mettre en évidence l’aspect en partie modulaire dela dysferline. Une autre donnée sur le caractère modulaire de la dysferline est apparue dans la littérature, cette foismontrant le caractère dispensable de l’exon 32. Sur la base de cette observation clinique, nous avons développéune approche thérapeutique par saut d’exon pour les dysferlinopathies, en démontrant dans un premier temps safaisabilité technique sur l’exon 32.L’ensemble de ces travaux permettront probablement l’amélioration du diagnostic différentiel desdysferlinopathies, tout en fournissant de nouvelles pistes pour comprendre les rôles de la dysferline et offrir ainsides pistes thérapeutiques pour le traitement de patients souffrant de ces pathologies.

Dysferlinopathies are a group of autosomal recessive muscular disorders including mainly limb girdlemuscular dystrophy 2B (LGMD2B) and Miyoshi Myopathy (MM), caused by mutation in DYSF gene (2p13.1-13.3). It is composed by 55 exons spreading on 234 kb of genomic DNA and it is expressed mainly in skeletal and heart muscle and monocytes/macrophages.Dysferlin (2080 amino-acids, molecular weight 237 kDa) belongs to the Ferlin family as Myoferline, which is also expressed in muscle. Dysferlin is involved with Myoferlin in myoblasts fusion and T-tubule formation. In adult skeletal muscle, Dysferlin is localized at the sarcolemma where it plays its main function: the sarcolemma repair after muscular wounding. It has been suggested that Dysferlin allows them to fuse with the plasma membrane in order to provide the required plasma membrane to reseal the wound. During these years, my work was essentially focused on the improvement of diagnosis technique (evaluation of CGH array to detect deletion/duplication event in DYSF gene and development of test able to detect absence/presence of Dysferlin in whole blood), the functional exploration of diagnosis technique (evaluation of CGH array to detect deletion/duplication event in DYSF gene and development of test able to detect absence/presence of Dysferlin in whole blood), and the development of promising therapeutics approaches: AAV gene transfer of a minidysferlin which was identified in patient presenting a mild phenotype and for the first time the demonstration of the feasibility of an exon-skipping therapeutics strategy for dysferlinopathies.