Etude du transcriptome kératinocytaire au cours du programme de différenciation de l'épiderme

A study of the transcriptome of keratinocytes during the epidermal differentiation

• Auteur / Autrice : Nicolas Mattiuzzo
• Direction : Marina Weber Vivat
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Gènes, cellules et développement
• Date : Soutenance en 2009
• Etablissement(s) : Toulouse 3

Mots clés

Mots clés contrôlés

Transcriptome

Kératinocytes

Épiderme

Mots clés libres

Epiderme

Différenciation

Kératinocyte

Transcriptome

Bioanalyse

Facteurs de transcription

Expression génique

Résumé

Au sein de l'épiderme, la fonction de barrière est assurée par la partie la plus superficielle, la couche cornée, constituée de cornéocytes, des cellules mortes très cohésives entourées d'une matrice lipidique. Un processus complexe de mort cellulaire programmée, la cornification, aboutit à la transformation des dernières cellules vivantes, les kératinocytes granuleux, en cornéocytes dépourvus d'activité transcriptionnelle et traductionnelle. Les kératinocytes granuleux constituent donc à la fois le stade ultime de la différenciation épidermique, mais aussi celui où sont produits les différents acteurs de la cornification et de la desquamation, donc de la fonction barrière. Très peu d'études moléculaires systématiques ont été consacrées à l'épiderme humain, et seulement quatre facteurs de transcription spécifiques requis pour la fonction barrière ont été identifiés. Le travail présenté ici combine plusieurs techniques à grande échelle afin d'identifier de nouveaux gènes impliqués dans les étapes tardives de ce programme. Un procédé de purification de cellules à partir d'épiderme humain normal a été développé afin d'obtenir des fractions enrichies en kératinocytes de différents stades de différenciation. Ce procédé, couplé à la technique des ORESTEs, a permis dans un premier temps de produire 22 000 séquences et d'identifier 3387 gènes exprimés dans la couche granuleuse, parmi lesquels de nouveaux marqueurs de la différenciation impliqués dans diverses fonctions (protéine structurale, métabolisme et transport des lipides, protéase et inhibiteurs, etc. ) Les profils d'expression génique des kératinocytes granuleux ont également été comparés avec ceux des kératinocytes basaux au moyen de puces à ADN pangénomiques, mettant en évidence 200 candidats. Afin d'identifier des facteurs de transcription supplémentaires, une recherche bioinformatique de sites de fixation conservés évolutivement a été réalisée sur les promoteurs de 52 marqueurs de la différenciation. Les résultats issus de ces trois techniques ont été combinés et analysés afin de réduire à 300 gènes le nombre de candidats à valider. Pour 155 d'entre eux, leur profil d'expression au sein de l'épiderme a pu être analysé par PCR quantitative, permettant d'identifier 49 nouveaux marqueurs de la différenciation. De plus, sur 94 gènes quantifiés codant pour des facteurs de transcription, 37 apparaissent positivement ou négativement régulés, suggérant un rôle dans le contrôle des étapes tardives du programme de différenciation. Ces résultats ouvrent de nombreuses voies et constituent donc une avancée importante pour la compréhension des mécanismes complexes mis en jeu dans ce réseau de régulation génique, tant dans le cadre physiologique que pour certaines pathologies caractérisées par une altération de la différenciation, comme dans le cas du psoriasis ou des ichthyoses.

The barrier function of the epidermis is provided by its outermost part, the cornified layer, formed by corneocytes, strongly interconnected dead cells surrounded by a lipid-rich extracellular environment. A complex programmed cell death, named cornification, turns the last living cells, granular keratinocytes, into dead corneocytes devoid of transcriptional and translational activity. Since all the constituents of corneocytes as well as the enzymes regulating their release leading to the desquamation are produced by granular keratinocytes, they do not only represent the last step of epidermal differentiation, but also its climax. Very few large-scale studies have been performed on human epidermis, and until now only four transcription factors required for the barrier function were described. The present work combines several large-scale techniques in order to identify new genes, especially transcription factor (TF)-coding genes, potentially involved in the last step of epidermal differentiation. Based on a purification process using iterative trypsinizations of chilled epidermis fragments, we recovered cell fractions enriched in keratinocytes from various differentiation states. This process, used together with the ORESTEs technique, allowed the production of more than 22000 sequences corresponding to 3387 genes expressed in the granular layer, including new differentiation markers involved in various functions (structural protein, lipid metabolism and transport, protease and inhibitors, etc). Gene expression profile of granular keratinocytes was also compared with basal keratinocytes' one using pangenomic microarrays, highlighting 200 candidates. To identify some additional TF-coding genes, a study of conserved TF binding site was performed by bioinformatics on the promoters of 52 differentiation markers. The results produced by these three techniques were combined and analyzed to select 300 candidates to be validated by real-time PCR. Among them, 155 could be reliably quantified, including 49 new differentiation-associated genes. Moreover, 37 of 94 TF-coding genes appeared to be up- or downregulated in granular keratinocytes, suggesting a function in the regulation of the differentiation. These advances made in the field of normal keratinocyte differentiation should improve the knowledge of the complex regulatory networks driving the formation of the epidermal barrier, and may also contribute to the deciphering of complex diseases such as atopic dermatitis, psoriasis and ichthyoses, which are characterized by deregulated differentiation programs.