Ingénierie d'une protéase monospécifique pour le diagnostic du glucose sanguin

Engineering of a monospecific protease for blood glucose diagnostics

• Auteur / Autrice : Morgane Ciréfice
• Direction : Etienne Weiss
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences du vivant
• Date : Soutenance en 2009
• Etablissement(s) : Strasbourg

Mots clés

Mots clés contrôlés

Hémoglobine glyquée

Diagnostic

Diabètes

Sérine-protéases

Peptidases

Glucose sanguin

Résumé

Le dosage sanguin de la glycémie via le taux d´hémoglobine glyquée (HbA1c) est un paramètre-clé de la surveillance du diabète à long terme. Roche Diagnostics GmbH s´est engagé avec la Fédération Internationale de Chimie Clinique et de Médecine de Laboratoire (IFCC) à développer un système standard de référence international de contrôle de la glycémie. L´endopeptidase glutamique (GluC) de la souche V8 de Staphylococus aureus (EC 3. 4. 21. 19) est utilisée pour la digestion de l´HbA1c. L´objectif de cette thèse de doctorat est d´augmenter la vitesse d´hydrolyse de la GluC par évolution moléculaire tout en préservant ses caractéristiques enzymatiques originelles (spécificité et stabilité) dans les conditions standardisées du test fonctionnel de l´HbA1c. La construction de librairies de plusieurs milliers de variants, couplée à un criblage multiparamètre, a permis d’isoler un mutant de la GluC qui comporte les propriétés recherchées. Ce variant a été exprimé chez B. Subtilis par sécrétion extracellulaire et purifié par chromatographie d’affinité Ni-NTA. Il a été ensuite caractérisé après activation par autoprotéolyse. Le variant présente une activité spécifique 3 fois supérieure et une constante d’affinité (Km) trois fois meilleure à celle de la GluC sauvage pour le substrat synthétique: Z-Phe-Leu-Glu-pNa dans un tampon de Tris-HCl à pH 7. 8. Le variant est 4 fois plus actif dans un tampon d´acétate d´ammonium à pH 4. 3 avec l´hexapeptide de l´hémoglobine pour substrat. Il est également plus stable à 50°C. Bien que plus actif que la GluC sauvage en présence de substrats synthétiques, le variant isolé est moins performant d’un point de vue activité, affinité et spécificité de coupure pour l´hexapeptide de l´hémoglobine entière.

The blood glucose determination via the rate of glycated hemoglobin (HbA1c) is a key-parameter for long-term diabetes care. Roche Diagnostics GmbH committed itself with the International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine (IFCC) to develop an international reference standard system for blood sugar control. The glutamyl endopeptidase (GluC) from the V8 strain of Staphylococus aureus (EC 3. 4. 21. 19) is used for the HbA1c digestion. The aim of this phD project is to increase the hydrolysis speed of the GluC by directed evolution by keeping its original enzymatic characteristics (specificity and stability) in the standard conditions of the functional hemoglobin test. A variant with the improved enzymatic features was isolated and identified after the construction and the multiparameter screening of libraries of thousands of mutants. This variant of the glutamyl endopeptidase was expressed in B. Subtilis by extracellular secretion, and then purified by Ni-NTA affinity chromatography. It was then characterized after activation by autoproteolysis. The specific activity of the variant is three times enhanced and the affinity constant (Km) is 3 times improved in a Tris-HCl buffer at pH 7. 8, compared to the wild type glutamyl endopeptidase. The specific activity is four times better in ammonium acetate buffer at pH 4. 3 with the hemoglobin hexapeptide as substrate. It is also more stable at 50°C. However, although the variant is more active with synthetic substrate, it is less competitive than the wild type V8-Glutamyl endopeptidase regarding the activity, affinity and cutting specificity for the hexapeptide of the whole hemoglobin. Experiments are still discussed to optimize the conditions of the HbA1c test.