Fonctions et mécanismes d'action de l'ARNIII et de nouveaux ARN non codants de Staphylococcus aureus

Function and mecanism of action of RNAIII and new ncRNAs in Staphylococcus aureus

• Auteur / Autrice : Clément Chevalier
• Direction : Pascale Romby
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie moléculaire et structurale
• Date : Soutenance en 2009
• Etablissement(s) : Strasbourg

Mots clés

Mots clés contrôlés

Régulation génétique

Mécanisme d'action

ARN

Adaptation

Pathogénicité

Métabolisme

Ribonucléases

Virulence (microbiologie)

ARN interférence

Staphylocoque doré

ARN non codants

Résumé

Il est maintenant bien établi que l'ARN est un des acteurs clés de la régulation de l'expression des gènes dans tous les organismes vivants. Chez les bactéries, plus de 10% du génome est suspecté coder pour des ARN régulateurs. Alors que dans les bactéries Gram-négatif, plus de 80 ARN ont été identifiés et que plusieurs d’entre eux régulent divers processus adaptatifs (changement de l’environnement, stress, virulence), peu de données existaient dans les bactéries Gram-positif au début de ma thèse. L’objectif de mon projet a été de caractériser et d’analyser la fonction et les mécanismes d’action de nouveaux ARN dans la bactérie pathogène Staphylococcus aureus. Staphylococcus aureus produit un grand nombre de facteurs de virulence qui sont finement régulés par l‘intervention coordonnée de protéines et d’ARN. Ainsi, l'ARNIII qui est induit en réponse à la densité cellulaire, était connu pour réguler l’expression de plus de 40 gènes de virulence. Par l’utilisation combinée d’approches expérimentales complémentaires, nous avons montré que l’ARNIII agit principalement comme ARN antisens en se fixant à de multiples ARNm codant pour une famille de facteurs de virulence et pour la protéine de régulation de la transcription Rot. Dans tous les cas, l’ARNIII utilise un motif conservé riche en cytosines pour interagir avec ses ARNm. Selon la structure de l’ARNm, les complexes générés adoptent des topologies variées (duplex irrégulier, interaction boucle-boucle). Ces complexes stables empêchent la formation du complexe d’initiation de la traduction et génèrent des sites spécifiques pour l’endoribonucléase III (RNase III) qui initie la dégradation des ARNm réprimés. L’ARNIII et la RNase III agissent de manière coordonnée pour réprimer de manière irréversible la synthèse des facteurs de virulence. Par ailleurs, en réprimant la traduction de l’ARNm rot qui code pour un répresseur des exotoxines, l’ARNIII régule de manière indirecte l’expression de nombreux autres gènes. L'ensemble de nos données a permis d’intégrer l’ARNIII dans un réseau de régulation complexe de la virulence. Dans le but d'élargir ce réseau, nous sommes ensuite partis à la recherche de nouveaux ARN non-codants (ARNnc). Une approche de génomique comparative des régions intergéniques incluant différents outils bioinformatique et l’analyse de leur expression nous ont conduit à l’identification de 11 nouveaux ARNnc (RsaA-K) de S. Aureus. Alors que ces ARN sont tous stables et majoritairement exprimés en phase stationnaire, leurs tailles et leurs degré de conservation sont différents. Leur expression est régulée en réponse à divers stress et par différents régulateurs de la transcription, comme le facteur Sigma B. Bien que la fonction de la plupart de ces ARN reste encore à déterminer, nous avons montré que RsaE réprime la synthèse de plusieurs protéines impliquées dans diverses voies métaboliques. La plupart de ces ARN possèdent le même motif riche en C que l'ARNIII, indiquant l'existence d'une classe d'ARNnc qui agirait par un mécanisme commun sur leurs gènes cibles. Toutes nos données permettent d’ores et déjà d’appréhender les réseaux de régulation dans lesquels ces ARN sont impliqués et suggèrent des connections possibles entre le métabolisme, la réponse au stress et la virulence de S. Aureus.

To date, it is well established that RNA play a key role in gene regulation. In bacteria, more than 10% of the genome is supposed to encode for regulatory RNAs. Whereas in Gram-negative bacteria more than 80 non coding RNAs (ncRNA) have been identified to be involved in various processes (virulence, stress, environmental changes), only few were identified in Gram-positive bacteria when I started my thesis. Thus, the aim of my work was to identify and analyze the function and the mechanisms of action of new ncRNAs in the pathogenic bacterium Staphylococcus aureus. Staphylococcus aureus expresses more than 50 virulence factors that are tighly regulated by proteins but also, in some cases, by RNAs. For example, RNAIII which responds to cell density, was known since several years to regulate by itself the expression of 40 virulence factors. Using different complementary approaches, we have shown that RNAIII acts mainly as an antisens RNA and binds multiple mRNAs encoding either virulence factors or the transcriptional regulator Rot. In each case, RNAIII uses a conserved C rich motif to interact with its mRNA targets. According to the structure of the mRNAs, these interactions lead either to the formation of an extending duplex or a loop-loop complex. These interactions prevent the formation of the ternary complex of translation initiation and further allow a rapid degradation of mRNAs by the RNAse III. Thus, RNAIII and RNase III act in a coordinated way to irreversibly repress the expression of the virulence factors. In addition, by repressing rot mRNA, which encodes for a repressor of toxins, RNAIII indirectly regulates many others genes. These data confirmed that RNAs may be key factors in a complex regulatory network of virulence. In order to unravel whether other non coding RNAs could be involved in virulence regulation, we decided to identify new ncRNAs in S. Aureus. We focused our attention on intergenic regions and using different bioinformatic tools, we finally identified 11 new ncRNAs (RsaA-K) in S. Aureus. Whereas most of these RNA are stable and expressed in stationary growth phase, their size and their conservation vary. Interestingly, most of Rsa RNA carry the same C rich motif than RNAIII suggesting a common mechanism to regulate gene expression. Although the function of most of Rsa RNA is still unknown, we showed that RsaE, whose expression is induced by the agr system, represses the translation of several proteins involved in the metabolism. All together, our data suggest the existence of a link between metabolism, stress response and virulence.