Régulation de l'arrêt des endomitoses et de la différenciation mégacaryocytaire terminale : rôle de p19 INK4D et de MAL

Regulation of endomitosis and terminal differentiation in Megakaryocytes : role of MAL and p19INK4D

• Auteur / Autrice : Laure Gendre-Gilles
• Direction : Hana Raslova
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie des cellules sanguines
• Date : Soutenance en 2009
• Etablissement(s) : Paris 7

Mots clés

Mots clés contrôlés

Mégacaryocytes

Mitose

Différenciation cellulaire

Ploïdies

Inhibiteur p19 de kinase cycline-dépendante

Résumé

La mégacaryopoïèse est le système de production et de régulation de la production des plaquettes et se divise en trois étapes: étape pendant laquelle les cellules font des mitoses, polyploïdisation par endomitose, libération des plaquettes par fragmentation du cytoplasme. Le travail de ma thèse a concerné la mégacaryopoïèse à travers l'étude de 2 protéines : MAL et p19INK4D (p19). MAL qui est le cofacteur transcriptionnel de SRF est aussi impliqué dans une translocation retrouvée dans les leucémies aiguës à mégacaryoblastes. Nous avons montré que son expression augmente avec la différenciation mégacaryocytaire et qu'en son absence, l'organisation du cytosquelette est fortement perturbée. Dans ces conditions, la migration et la formation des proplaquettes sont inhibées. Deux gènes présentent une expression fortement diminuée en l'absence de MAL dans les mégacaryocytes (MK), MMP-9 et MYL-9. Ces 2 gènes sont directement régulés par le complexe transcriptionnel MAL/SRF. Le défaut de migration que nous avons mis en évidence pourrait être lié à la diminution de MMP-9. Nous avons enfin montré qu'un défaut quantitatif de MYL-9 altère la formation des proplaquettes. Le seul inhibiteur du cycle cellulaire dont l'expression augmente linéairement avec la ploïdie est p19. Nous avons montré que cette protéine constitue un lien entre l'arrêt des endomitoses et la différenciation terminale des MK. Ces résultats ont été confirmés par l'étude des souris p79⁻⁄⁻A chez qui la ploïdie modale des MK est fortement augmentée. Enfin, l'expression de p19 est régulée par le facteur de transcription hématopoïétique AML-1, impliqué à différents niveaux de l'hématopoïèse.

Megakaryopoiesis is the System of platelet production divided in three steps: mitosis step, increase in ploidy level by endomitosis, platelet sheeding by cytoplasm fragmentation. My work focused on megakaryopoiesis through the study of two proteins: MAL and p19INK4D (p19). MAL is a transcriptional co-activator of SRF. In acute megakaryoblastic leukemia, thé MAL gene is translocated and fused with the gene encoding OTT. We showed that MAL expression increases during the megakaryocyte (MK) differentiation. MAL knockdown in MK progenitors reduced the percentage of cells forming filopodia, lamellipodia and stress fibers, and reduced proplatelet formation. MAL repression led to dysmorphic MK with disorganized demarcation membranes and alpha granules heterogeneously scattered in the cytoplasm. Gene expression profiling revealed a decrease in MMP9 and MYL9 expression after MAL inhibition. Chromatin immunoprecipitation in MK showed that the MAL/SRF complex directly regulates MYL9 and MMP9. MK migration was considerably decreased after MAL knock down, implicating MMP9 in migration. Finally, the use of a shRNA to decrease MYL9 expression showed that MYL9 was involved in proplatelet formation. P19 expression was increased during ploidization. We showed that p19 knockdown led to an increase in the mean ploidy of human MKs. This increase in ploidy was associated with a decrease in the more mature MKpopulation. Inversely, p19 overexpression resulted in a decrease in mean ploidy level. Confirming these results, bone marrow MKs from p19 KO mice exhibited an increase in mean ploidy level. Finally we showed that p19 is directly regulated by the hematopoietic transcription factor AML1.