Caractérisation moléculaire de la résistance croisée fluorocytosine-fluconazole chez la levure opportuniste pathogène Candida lusitaniae

• Auteur / Autrice : Martine Fournier
• Direction : Thierry Noël
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Pharmacie
• Date : Soutenance en 2009
• Etablissement(s) : Paris 5
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale du Médicament (....-2009 ; Paris)
• Partenaire(s) de recherche : autre partenaire : Université Paris Descartes. Faculté de pharmacie de Paris (....-2019)

Mots clés

Mots clés contrôlés

Flucytosine

Fluconazole

Chimiothérapie

Candidose

Résistance aux antifongiques

Candida lusitaniae

Résumé

Le but de notre étude était de comprendre les événements moléculaires liés aux mécanismes de résistance à la 5FC chez Candida lusitaniae. Les principaux gènes du métabolisme de la 5FC　: FCY2, FCY1 et FUR1 ont été invalidés par recombinaison homologue intragénique d'une séquence contenant　: à la fois le gène URA3 de Candida lusitaniae (marqueur de sélection), entouré des séquences REP (séquences répétitives) et à la fois des régions homologues du gène cible. La recombinaison homologue des séquences a permis la sélection des génotypes　: fcy2 (fcy2D 　:　:REP-URA3-REP), fcy1(fcy1D 　:　:REP-URA3-REP) et fur1 (fur1D 　:　:REP-URA3-REP). Les mutants fcy2 et fcy1 étaient résistants à la 5FC (bas niveaux) et à l’association 5FC/FLC (fluconazole). Le mutant fur1 était résistant à la fois à la 5-FC et au 5-fluorouracile (5FU) avec des niveaux de résistance très élevés à ces deux antifongiques, sans résistance croisée 5FC/FLC. La deuxième approche a été l’étude de onze isolats cliniques de Candida lusitaniae présentant une résistance à la 5FC et une résistance croisée 5FC/FLC. L’analyse de la séquence nucléotidique du gène FCY2 a montré chez 7 isolats cliniques une substitution dans la région codante en position 505 de la PCP ce qui engendre un codon STOP (CAG devient TAG). La réintroduction de l’allèle FCY2 sauvage au locus fcy2 muté permet de restaurer la sensibilité à la 5FC. Concernant les quatre isolats cliniques restants, l’analyse de la séquence nucléotidique de FCY1 a retrouvé une mutation T26C qui se traduit par une substitution d’une méthionine par une thréonine en position 9 de la cytosine déaminase. La réintroduction de l’allèle FCY1 sauvage au niveau du locus fcy1 muté permet de retrouver un phénotype sensible à la 5FC ce qui n’est pas le cas lors de l’introduction de l’allèle fcy1(T26C) muté.

The aim of this work was to understand the molecular mechanisms of flucytosine (5FC) resistance and 5FC/fluconazole (FLC) by Candida lusitaniae. In the first part, we disrupted the main genes of 5FC metabolism : FCY2, FCY1 and FUR1 by homologous recombination with a linear cassettes containing the C. Lusitaniae URA3 gene flanked by direct repeats (REP), plus regions homologous to the target genes. We selected the mutant fcy2 (genotype : fcy2D ::REP-URA3-REP), the mutant fcy1 (genotype : fcy1D ::REP-URA3-REP) and the mutant fur1 (fur1D ::REP-URA3-REP). Mutants fcy2 and fcy1 were 5FC-resistant and cross-resistant to 5-FC and FLC when both antifungals were used in combination. The mutant fur1 was cross-resistant to 5-FC and 5FU (5-fluorouracil). In the second part, we studied 11 clinical isolates of C lusitaniae. Nucleotide sequencing of the FCY2 alleles revealed that the 5FC and 5FC/FLC resistance could be correlated with a cytosine to thymine substitution at nucleotide 505 in the FCY2 gene of seven isolates, resulting in a non-sense mutation. Reintroducing a FCY2 wild-type allele at the fcy2 locus restored susceptibility levels to antifungals comparable to those of the wild-type strains. In the remaining four isolates, a polymorphic nucleotide was found in FCY1 where the nucleotide substitution T26C resulted in the amino acid replacement met9thr in cytosine deaminase. Antifungal susceptibility was restored by introducing a wild-type FCY1 allele but failed by introducing mutated allele. We thus, found a correlation between the fcy1 T26C mutation and both 5FC and 5FC/FCZ resistance. We demonstrated that only two genetic events occurred in 11 unrelated clinical isolates of C lusitaniae for supporting 5FC and 5FC/FCZ resistance