Bases moléculaires de la régulation de l'activité des canaux potassiques de type Shaker chez les plantes

• Auteur / Autrice : François Pascaud
• Direction : Benoît Lacombe, Jean-Baptiste Thibaud
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie intégrative des plantes
• Date : Soutenance en 2009
• Etablissement(s) : Montpellier SupAgro

Mots clés

Mots clés contrôlés

Arabidopsis thaliana

Physiologie végétale

Mots clés libres

Biologie moléculaire

Canal potassique

Phosphorylation

électrophysiologie

Interaction protéine-protéine

Résumé

Chez Arabidopsis thaliana, les canaux potassiques de la famille Shaker sont les mieux caractérisés aux niveaux physiologique et fonctionnel, mais les mécanismes moléculaires de leur régulation post?traductionnelle restent méconnus. L'étude en système hétérologue des caractéristiques fonctionnelles du canal AKT2 et la découverte d'une phosphatase, AtPP2CA, susceptible de réguler son activité, nous ont conduit à choisir AKT2 comme canal modèle pour l'étude de la régulation des canaux Shaker par des mécanismes de phosphorylations réversibles. Mes travaux rapportent l'identification d'un complexe protéique composé d'un senseur de calcium (CBL4, Calcineurin?B Like 4) et d'une protéine kinase (CIPK6, CBL?Interacting Protein Kinase 6) régulant l'activité d'AKT2. Des expériences de BiFC démontrent ainsi qu'in planta ces trois protéines interagissent et dans l'ovocyte, la co?expression d'AKT2 avec CIPK6 et CBL4 induit une stimulation d'AKT2 dépendante du calcium sans modification qualitative des propriétés fonctionnelles de ce canal. D'une manière intéressante, nos résultats diffèrent de ceux obtenus concernant la régulation d'AKT1 par CIPK23 et CBL1. En effet, la régulation d'AKT2 ne requiert pas l'activité kinase de CIPK6 et deux mécanismes distincts semblent impliqués : (1) Dans les cellules de tabac, CBL4 induit une relocalisation du complexe AKT2?CIPK6 vers la membrane plasmique et (2) dans l'ovocyte, CIPK6?CBL4 stabilise AKT2 dans un état hyperactif. Nous avons donc identifié un nouveau complexe CIPK?CBL régulant AKT2 par un mécanisme dépendant du calcium mais indépendant de l'activité kinase de CIPK6

Amongst the ion transport systems expressed in Arabidopsis thaliana, the Shaker-like K+ channels are the most characterized regarding both their functional features and their physiological role. Little is known, however, about molecular mechanisms underlying their post-translational regulation. Previous identification of AtPP2CA as a AKT2-targetting phospatase and detailed evidence that this Shaker channel activity is strongly dependent on its phosphorylation status pointed out AKT2 as a worth studying model. Here, we report on the identification of a protein complex made of a calcium sensing protein (CBL4, Calcineurin-B Like 4) and of a protein kinase (CIPK6, CBL-Interacting Protein Kinase 6), which is able to interact with and to strongly stimulate the channel activity of AKT2. BiFC experiments in Tobacco protoplasts demonstrated that these three proteins interact and traffic together to the cell membrane. Voltage-clamp experiments in Xenopus oocytes indicated that co-expression of CBL4 and CIPK6 with AKT2 increases AKT2 activity in a calcium-dependent manner without changing AKT2 voltage-gating properties. In contrast to recent report on AKT1 stimulation by the CIPK23-CBL1 complex, regulation of AKT2 activity by CIPK6 does not require the CIPK6 kinase activity. Two mechanisms are involved in this regulation: (1) CBL4 targets (Ca2+-dependently) the AKT2/CIPK6 complex to the plasma membrane (BiFC in Tobacco protoplasts) and (2) in presence of Ca2+, CIPK6-CBL4 complex seems able to protect AKT2 against rundown i. E. Against dephosphorylation (voltage-clamp on membrane patch excised from oocyte). In conclusion, we identified a new CIPK/CBL complex able to regulate AKT2 via a calcium-dependent but CIPK kinase activity-independent mechanism