Étude de la voie de présentation de l'antigène MMP-2 par les cellules tumorales

Study of the MMP-2 antigen presentation pathway by tumor cells

• Auteur / Autrice : Virginie Renaud
• Direction : Yannick Guilloux
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie. Immunologie
• Date : Soutenance en 2009
• Etablissement(s) : Nantes
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Biologie-Santé Nantes-Angers
• Partenaire(s) de recherche : autre partenaire : Université de Nantes. Faculté des sciences et des techniques

Mots clés

Mots clés contrôlés

Matrix metalloproteinase 2

Antigènes tumoraux

Mélanome

Résumé

Un nouvel antigène de tumeur, MMP-2, a été caractérisé dans notre laboratoire. Il est reconnu par un clone T CD8+ dans le contexte HLA-A*0201. De façon surprenante, les lignées de mélanome présentent cet antigène par la voie de présentation croisée (Godefroy et al. , 2005). Le sujet de cette thèse porte sur les mécanismes impliqués dans l’absence de présentation de la MMP-2 par la voie endogène. La MMP-2 est constitué de 8 ponts disulfures et nous avons voulu évaluer l’impact de ces ponts sur cette présentation. En remplaçant une cystéine par une alanine dans l’ADNc codant pour la MMP-2 puis en transfectant ces ADNc mutés dans des cellules tumorales, nous avons montré que l'élimination d’un pont disulfure dans la MMP-2 permet sa présentation par la voie endogène. Par cinétique de chasse, nous avons aussi démontré que la MMP-2 mutée est plus rapidement dégradée que la MMP-2 sauvage. La conformation de la MMP-2 semble jouer un rôle important dans son absence de présentation par la voie endogène classique. Ensuite, nous avons essayé de déterminer la voie cellulaire impliquée dans la présentation croisée de la MMP-2. En utilisant des drogues, nous avons mis en évidence que la présentation croisée de la MMP-2 nécessite la machinerie de rétrotranslocation, le protéasome et TAP, tous impliqués dans la voie de présentation endogène. Pour déterminer les compartiments impliqués dans cette présentation croisée, nous avons testé les « Organelles lights » (Invitrogen) dans le but de cibler des structures intracellulaires in vivo

From a patient still melanoma free after TIL injection, we characterized a new tumor antigen, MMP-2, recognized by a CD8 T cell clone in HLA-A*0201 context. Surprisingly melanoma cell lines present this tumor antigen by the cross presentation pathway (Godefroy & al. , 2005). In the first part, we wondered if disulfide bonds present in MMP-2 were not responsible for its absence of presentation by the endogenous pathway. By mutagenesis, we replaced a cystein by an alanine in the cDNA coding for MMP-2, in order to induce a disulfide bond deletion and then we transfected these cDNA mutants in COS-7 and human tumor cell lines. We showed that MMP-2 deletion of one disulfide bond induce its presentation by the endogenous pathway. By pulse chase experiments we also demonstrated that MMP-2 mutated form is more rapidly degraded than the wild form. MMP-2 folding and consequently conformation seems to play an important role in the absence of its presentation by the classical pathway. In the second part, we try to determine intracellular pathway implicated in MMP-2 cross-presentation in melanoma cells. Indeed, after secretion, MMP-2 is internalized by melanoma cells in an v3 dependent manner and by an unknown pathway. MMP-2 is finally processed by the proteasome and loaded on MHC class I molecule (Godefroy & al. , 2005). By using drugs, we determined that MMP-2 cross-presentation involves the retrotranslocation machinery, the proteasome and TAP, all implicated in the endogenous pathway. To determine compartments necessary to MMP-2 cross-presentation we tested Organelles lights (Invitrogen). These reagents provide a method for targeted specific subcellular structures within living cells