Méthode de criblage haut-débit pour l'évolution dirigée de glycosidases en transglycosidases : application à la β-glycosidase de Thermus thermophilus

High-throughput screening methodology for directed evolution of glycosidases into transglycosidases : application to Thermus thermophilus beta-glycosidase

• Auteur / Autrice : Fankroma Martial Thierry Koné
• Direction : Jean-Pierre Sine, Charles Tellier
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biochimie
• Date : Soutenance en 2009
• Etablissement(s) : Nantes
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Biologie-Santé Nantes-Angers (2008-2021)
• Partenaire(s) de recherche : Autre partenaire : Université de Nantes. Faculté des sciences et des techniques

Mots clés

Mots clés contrôlés

Mutagenèse

Mots clés libres

Evolution dirigée

Criblage

Imagerie digitale

Mutagenèse

Transglycosidase

Glycosidase

N-Acetyl-Glucosaminidase

Résumé

L’évolution dirigée constitue une nouvelle approche pour explorer les relations structure/fonction des protéines et constitue également une stratégie efficace pour générer de nouvelles activités enzymatiques. Cependant, l'ingénierie de transglycosidases par les méthodes d'évolution dirigée est limitée par l’absence de systèmes de criblage à haut débit pour ces activités enzymatiques. Nous avons développé dans ce travail une nouvelle méthode de criblage haut-débit qui permet de détecter sur des colonies intactes de E. Coli, une activité transférase sur des mutants de glycosylhydrolases faiblement hydrolytiques. Cette méthode est basée sur le suivi par imagerie digitale de la réactivation des mutants par un accepteur de groupement glycosyle. Cette approche a été appliquée a la β-glycosidase de Thermus thermophilus (Ttβgly), enzyme appartenant à la famille 1 des glycosylhydrolases, dans le but de la faire évoluer en transglycosidases. Avec les meilleurs clones isolés par cette stratégie, des rendements de transglycosylation de 70 - 80 % sont atteints pour la synthèse de trisaccharides (Gal-cellobiose). Cette stratégie a été ensuite testée pour le criblage d’autres activités transglycosidasiques de manière à cerner les limites de ce criblage. En particulier, deux systèmes d’exportation (TAT et SRP) des mutants dans le périplasme ont été évalués pour permettre d’appliquer le criblage sur des substrats donneur ou accepteur qui ne pénètrent pas dans la bactérie. Enfin, une activité N-acetyl-glucosaminidase a été génére��e de novo sur la Ttβgly par une approche mixte de mutagenèse dirigée et aléatoire. En fonction des mutations introduites, nous montrons qu’il est possible de contrôler le type de mécanisme utilisé pour l’hydrolyse.

Directed evolution provides a new approach to explore the structure/function relationship in proteins and also provides an efficient strategy to generate new enzymatic activities. However, the engineering of transglycosidases by directed evolution methodologies is limited by the lack of high-throughput screening systems for these enzymatic activities. In this work we developed a new high-throughput screening method (HTS) which allows the detection of transferase activity of low hydrolytic glycosylhydrolases mutants in intact E. Coli cells. This method is based on the digital imaging monitoring of reactivation of mutants by an acceptor of glycosyl group. This approach has been applied to the glycosylhydrolases family 1 β-glycosidase from Thermus thermophilus (Ttβgly), in order to reveal evolution toward transglycosidase. From the best isolated clones obtained by this strategy, yields of transglycosylation up to 70 - 80 % were performed for trisaccharides synthesis (Gal-cellobiose). This strategy has also been tested for the screening of other transglycosidases activities in order to determine the limits of this screening. In particular, two export systems (TAT and SRP) of mutants in the periplasmic space have been tested to apply the screening on donor or acceptor substrates which do not penetrate in the bacterium. Finally, de novo N-acetyl-glucosaminidase activity has been generated on the Ttβgly by a mixed approach of directed and random mutagenesis. According to the mutations performed, we show that it is possible to control the type of mechanism used for the hydrolysis.