Validation d'outils moléculaires pour la cancérologie clinique : Etude de l'expression des récepteurs aux rétinoïdes dans les cancers bronchiques

Signalling with Retinoids in the Human Lung : Validation of New Tools for the Expression Study of Retinoids Receptors

• Auteur / Autrice : Stéphane Poulain
• Direction : Nadine Martinet
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie Cellulaire et Nutrition
• Date : Soutenance le 12/06/2009
• Etablissement(s) : Nancy 1
• Ecole(s) doctorale(s) : BioSE
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Pathologie cellulaire et moléculaire en nutrition
• Jury : Président / Présidente : Jean-Michel Vignaud
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Nadine Martinet, Caroline Leroux, Christian Bronner, Jean-Louis Guéant, Marie-Christiane Carré, Stanislas du Manoir, Jean-Michel Vignaud
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Caroline Leroux, Christian Bronner

Mots clés

Mots clés contrôlés

Rétinoïdes

Chimioprophylaxie

Poumon -- Cancer

Mots clés libres

Récepteurs aux rétinoïdes

Résumé

Les Récepteurs aux Rétinoïdes sont impliqués dans le développement et dans l’homéostasie cellulaire. Des altérations de leurs expressions ont été observées dans les cancers bronchiques. Cependant, les essais de chimioprévention utilisant les rétinoïdes dans des populations à risques ont échoué. Par conséquent, avant de procéder à de nouveaux essais cliniques utilisant des rétinoïdes de seconde génération, il apparaît nécessaire de mieux comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans la signalisation des rétinoïdes. Tel est ici notre objectif en présentant la validation d’outils de recherches destinés à l’étude de ces récepteurs, et en particulier à celle du Récepteur à l’Acide Rétinoïque ß, dont le rôle majeur dans le cancer du poumon est documenté. Des outils bioinformatiques ont été utilisés afin de reconstituer in silico l’organisation génomique de RARß. Les caractéristiques d’un promoteur potentiel P1’-RARß ont été étudiées expérimentalement. Des mesures spécifiques, réalisées dans des essais de qRT-PCR Syber Green et avec un triplex de sondes Taqman, ont été validées extensivement afin d’établir des valeurs de référence de l’expression ARNm des Récepteurs aux Rétinoïdes dans les cellules épithéliales bronchiques humaines normales. Les expressions relatives des différentes isoformes ARNm RRs ont ensuite été quantifiées dans des échantillons de tumeurs bronchiques ainsi que dans plusieurs lignées de cellules cancéreuses. Enfin, un anticorps reconnaissant toutes les isoformes protéiques RARß, a été conçu et validé extensivement par western-blot et immunoprécipitation. Aucune activité promotrice n’a pu être démontrée pour P1’-RARß. Une augmentation des quantités d’ARNm P2-RARß signe la différenciation normale de l’épithélium bronchique, alors qu’une diminution significative de ces ARNm est observée dans la plupart des lignées de cellules cancéreuses bronchiques. Une sous-régulation concomitante de RARß et RXRß a également été mise en évidence dans les tumeurs bronchiques. En utilisant des extraits nucléaires de cellules BEAS-2B et de cellules bronchiques normales, seule l’isoforme protéique longue RARß2 a été reconnue par notre anticorps. Un traitement rigoureux des échantillons ainsi qu’une analyse bioinformatique exhaustive sont les points clés de cette étude. Des valeurs ARNm de référence ainsi que des outils validés sont maintenant disponibles pour faire progresser la recherche sur le signal rétinoïde dans les cellules bronchiques.

Retinoid Receptors are involved in development and cell homeostasis. Alterations of their expressions have been observed in lung cancer. However, retinoid chemoprevention trials in populations at risk to develop such tumours have failed. Therefore, the pertinence of new clinical trials using second generation retinoids requires prior better understanding of the molecular mechanisms involved in the retinoid signalling. This is our aim when validating extensively research tools, focused on the Retinoic Acid Receptor ß, whose major role in lung cancer is documented. Biocomputing was used to draw in silico an updated RARß genomic organisation. Features of a putative P1'-RARß promoter were investigated experimentally. Specific measures realised, with qRT-PCR Syber Green assays and a triplex of Taqman probes, were extensively validated to establish Retinoid Receptors mRNAs reference values for normal human bronchial epithelial cells. Relative expressions of the different RRs mRNA isoforms were further quantified in lung tumour samples and in several cancer cell lines. Finally, an antibody recognising all the RARß protein isoforms, was generated and extensively validated by western-blot and immunoprecipitation. No promoter-like activity was found for P1'-RARß. P2-RARß mRNA increase signs the normal differentiation of the human bronchial epithelium while a significant decrease is observed in most lung cancer cell lines. Accordingly, it is also, along with RXRß, down-regulated in lung tumours. When using nuclear extracts of BEAS-2B and normal lung cells, only the P2-long RARß2 protein isoform was recognised by our antibody. Rigorous samples processing and extensive biocomputing, were the key factors for this study. mRNA reference values and validated tools are now available to advance researches on retinoid signalling in the lung.