GABA-B receptor activation : a complex allosteric machine to tune up synaptic transmission

Analyse de l'activation du récepteur GABA-B : une machinerie complexe de la transmission synaptique

• Auteur / Autrice : Carine Monnier
• Direction : Jean-Philippe Pin
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Neurosciences
• Date : Soutenance en 2009
• Etablissement(s) : Montpellier 2

Mots clés

Mots clés contrôlés

Récepteurs GABA-B

Activation de la transcription

Récepteurs couplés aux protéines G

Mots clés libres

Gaba-b

Récepteur couplé aux protéines G

Transactivation

Oligomérisation

FRET en temps résolu

Marquage covalent

Résumé

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) constituent la plus grande famille de récepteurs membranaires et sont la cible de plus de 25% des médicaments. La compréhension des mécanismes moléculaires de l'activation de ces complexes oligomériques est cruciale pour le développement de drogues plus efficaces. Notre modèle d'étude, le récepteur métabotrope de l'acide γ-amino-butyrique (GABA-B), le principal neurotransmetteur inhibiteur du système nerveux central, module la transmission synaptique et constitue une cible pharmacologique pour le traitement de nombreux troubles neurologiques et psychiatriques incluant l'anxiété, l'épilepsie ou l'addiction aux drogues. Le récepteur GABA-B est un hétérodimère obligatoire formé de deux sous-unités GB1 et GB2, composées chacune d'un domaine extracellulaire appelé Vénus flytrap (VFT) et d'un domaine à sept helices transmembranaires (7TM) commun à tous les RCPG. Le VFT de GB1 lie le GABA, tandis que le domaine 7TM de GB2 contient le site de liaison de modulateurs allostériques positifs et est responsable du couplage à la protéine G. Mon travail de thèse a eu deux objectifs : (i) au niveau fondamental, il a consisté à mieux comprendre le mécanisme moléculaire d'activation du récepteur GABA-B. Nous avons démontré l'importance du mouvement relatif des VFT de GB1 et GB2 pour l'activation du récepteur, en développant l'approche « glycan wedge scanning ». D'autre part, nous avons démontré que la transactivation directe entre les deux domaines 7TM de l'hétérodimère représente une étape clé dans l'activation du récepteur ; (ii) au niveau technologique, j'ai mis en place un système senseur de l'état d'activation du récepteur GABA-B exprimé à la surface de cellules vivantes en utilisant de nouvelles techniques de marquage en fluorescence, compatibles avec des mesures de FRET en temps résolu. Pour cela, j'ai développé une méthode de marquage orthogonal entre un ACP-tag inséré dans une sous-unité et un Snap-tag fusionné à l'autre sous-unité. La mise en place de ce senseur devrait conduire à un nouveau test de criblage de molécules spécifiques du GABA-B, à moyen ou haut débit

G-protein coupled receptors (GPCRs) constitute the largest family of membrane receptors, and the target of more than 25% of drugs on the market. Understanding the molecular mechanisms of the activation of such oligomeric complexes is crucial to develop more potent drugs. The metabotropic γ-aminobutyric acid receptor (GABA-B) is activated by the main inhibitory neurotransmitter of the central nervous system (GABA). It plays an important role in brain functions and as such, it is a potential therapeutic target for the treatment of various neurologic and psychiatric disorders (anxiety, epilepsy or drug addiction). The GABA-B receptor is an obligatory heterodimer composed of two subunits, GB1 and GB2, each of them possessing an extracellular domain called Venus flytrap (VFT) and a seven transmembrane domain (7TM) common to all GPCRs. The VFT of GB1 contains the GABA binding site whereas 7TM domain of GB2, where the positive allosteric modulators bind, is responsible for G-protein activation. My doctoral research project had two main objectives. The first one was to better understand the molecular mechanism underlying the activation of GABA-B receptor. We first demonstrated the importance of the relative movement of GB1 and GB2 VFT domains in the activation, using a « glycan wedge scanning » approach. In addition, we showed a direct transactivation between the two 7TM that is a key step in GABA-B activation. The second objective was the development of a sensor to monitor the GABA-B receptor activation at the cell surface of living cells. This sensor, based on GABA-B receptor conformational changes during activation used new fluorescent tools compatible with time-resolved FRET experiments. To this aim, we set up an orthogonal labelling between an ACP-tag inserted in a loop of one subunit and a Snap-tag fused to the other. This sensor of GABA-B activation should lead to the development of a medium or high throughput screening of specific GABA-B molecules