Etude d'agents bioactifs et de neurotoxines isolés à partir d'organismes marins

• Auteur / Autrice : Sébastien Schlumberger
• Direction : Jordi Molgo
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Milieux et peuplements aquatiques. Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie
• Date : Soutenance en 2009
• Etablissement(s) : Paris, Muséum national d'histoire naturelle
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences de la nature et de l'Homme - Évolution et écologie (Paris)
• Jury : Président / Présidente : Daniel Gillet
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Luis M. Botana
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Zouher Amzil, Jan Tytgat

Mots clés

Mots clés contrôlés

Organismes marins

Agents neurotoxiques

Résumé

Notre travail porte sur l’étude des propriétés pharmacologiques d’agents bioactifs, et plus particulièrement de neurotoxines, issus d’organismes et de micro-organismes marins dans le but de déterminer leurs modes d’action, leurs cibles moléculaires et les altérations morphologiques et fonctionnelles qu’ils provoquent. Au moyen de techniques d’électrophysiologie et d’imagerie en micro-spectrofluorométrie confocale, nous avons étudié les activités de polyéthers issus du dinoflagellé Gambierdiscus toxicus [la ciguatoxine 1 des Caraïbes (C-CTX-1), la ciguatoxine 4B du Pacifique (P-CTX-4B) et le gambierol], ainsi que celles d’un peptide du venin du cône piscivore Conus consors (la µ-conotoxine CnIIIC), au niveau d’axones myélinisés, de préparations neuromusculaires squelettiques, de neuroblastomes et de cellules chromaffines fœtales de vertébrés. Les principaux résultats obtenus montrent que: (i) la C-CTX-1, à des concentrations nanomolaires, provoque des contractions musculaires asynchrones et dépolarise la membrane musculaire. De plus, elle augmente la libération quantique spontanée d’acétylcholine (ACh), de façon soutenue jusqu’à épuisement, et transitoirement la libération quantique provoquée par l’influx nerveux, puis la bloque complètement. Ces effets sont accompagnés d’une augmentation du volume de la terminaison nerveuse motrice qui peut être reversée par le D-mannitol hypertonique. La C-CTX-1 augmente également l’excitabilité nodale et prolonge la durée du potentiel d’action nerveux. L’ensemble de ces résultats suggère que la C-CTX-1 active les canaux Na+ sensibles au potentiel (VGSC) et inhibe les canaux K+ sensibles au potentiel (VGPC). (ii) La P-CTX-4B est un précurseur des ciguatoxines que l’on retrouve chez certains poissons ciguatériques du Pacifique. La P-CTX-4B bloque les courants Na+ et K+, sans affecter leurs cinétiques, et avec une plus grande affinité vis-à-vis de ces derniers. Elle est 4 fois plus active sur les VGPC et 50 fois moins active sur les VGSC que la P-CTX-1B. La P-CTX-4B modifie également la dépendance vis-à-vis du potentiel de l’activation et de l’inactivation des VGSC. La lidocaïne, un anesthésique local, affecte également les courants Na+, qu’ils soient ou non modifiés par la P-CTX-4B. Ces effets dépendent à la fois de sa concentration et du potentiel de membrane lors des pré-impulsions. (iii) Le gambierol est un inhibiteur de VGPC. Suite à la stimulation du nerf moteur, le gambierol augmente l’amplitude et la durée de la force contractile du muscle squelettique et provoque des contractions asynchrones, alors que suite à la stimulation directe du muscle, il n’en augmente que la durée. Le gambierol prolonge la phase de repolarisation des potentiels d’actions des fibres musculaires et provoque l’apparition de potentiels de plaque motrice et/ou de potentiels d’action musculaires spontanés et répétitifs. Il prolonge également la phase de repolarisation des potentiels d’actions de myocytes en culture, générés dans les conditions de courant imposé, suite à l’inhibition d’un courant K+ de type transitoire. Les résultats obtenus montrent que le gambierol affecte les VGPC post-synaptiques et suggèrent qu’il modifie l’excitabilité nerveuse terminale. (iv) Le gambierol, qui inhibe de façon spécifique les VGPC sans affecter les canaux potassium dépendants du calcium intracellulaire et ceux sensibles à l’ATP, ne modifie pas la libération de catécholamines au niveau des cellules chromaffines fœtales en culture. Le gambierol augmente le niveau de calcium pré-synaptique suite à la stimulation nerveuse. S’il n’exerce aucun effet sur la libération quantique spontanée d’ACh, le gambierol augmente la libération quantique provoquée par le potentiel d’action pré-synaptique et est capable de contrebalancer les effets bloquants post-synaptique de la d-tubocurarine et pré-synaptique de la toxine botulique de type A (BoTx-A). De plus, le gambierol augmente la libération quantique retardée d’ACh. (v) La superfamille des µ-conotoxines est connue pour bloquer les VGSC. La µ-CnIIIC a été purifiée à partir du venin de Conus consors, et synthétisée. Elle inhibe complètement la contraction des muscles squelettiques, qu’elles soient provoquées par la stimulation directe du muscle ou du nerf. La µ-CnIIIC inhibe le courant Na+ de neuroblastomes ainsi que celui de cellules HEK-293 et d’ovocytes de Xénopus exprimant le sous-type musculaire Nav1. 4. Finalement, la µ-CnIIIC est environ 10 fois plus efficace pour inhiber le potentiel d’action global des axones non myélinisés de brochet que celui des axones myélinisés de souris. Ces résultats montrent que la µ-CnIIIC est active sur les sous-types musculaires et neuronaux de VGSC. L’ensemble de ces résultats montrent la diversité d’action de neurotoxines issues d’organismes marins, ainsi que l’intérêt qu’il y a à poursuivre leur étude pour la compréhension des mécanismes physiopathologiques lors des intoxinations et pour le développement de nouveaux outils pharmacologiques.

The present work deals with the study of the pharmacological properties of bioactive agents, in particular neurotoxins, isolated from aquatic organisms and micro-organisms, to determine their functional alterations, molecular targets and mechanisms of action. Using electrophysiological techniques and micro-spectro-fluorometry confocal imaging, we have studied the activity of cyclic polyether toxins isolated from the dinoflagellate Gambierdiscus toxicus [the Caribbean ciguatoxin 1 (C-CTX-1), the Pacific ciguatoxin 4B (P-CTX-4B) and gambierol], and the activity of a peptide isolated from the venom of the piscivorous cone snail Conus consors (the µ-conopeptide CnIIIC), on myelinated axons, vertebrate skeletal neuromuscular preparations, mouse neuroblastoma and rat foetal chromaffin cells. The main results indicate that: (i) C-CTX-1, at nanomolar concentrations, induces asynchronous muscle contractions and depolarizes the muscle membrane. In addition, it increases spontaneous quantal acetylcholine (ACh) release, in a sustained manner until complete exhaustion of the transmitter stores. Furthermore, it increases transiently and blocks completely nerve-evoked quantal ACh release. Those effects are concomitant with an increase of nerve endings volume that could be reversed with hyper-osmolar D-mannitol. C-CTX-1 also increases nodal excitability and increases action potential duration. All together, results suggest that C-CTX-1 activates voltage gated Na+ channels (VGSC) and inhibits voltage gated K+ channels (VGPC). (ii) P-CTX-4B is the precursor of some Pacific ciguatoxins isolated from ciguateric fish. P-CTX-4B blocks Na+ and K+ currents without affecting their kinetics, with a higher affinity for the last one. It is 4 times more active on VGPC and 50 times less active on VGSC than P-CTX-1B. P-CTX-4B also modifies activation and inactivation voltage-sensitivity of VGSC. The local anaesthetic lidocaine affects in the same manner P-CTX-4B modified and unmodified Na+ currents. Those effects depend on both concentration and pre-pulse membrane potential. (iii) Gambierol is a VGPC inhibitor that increases isometric twitch tension in neuromuscular preparations stimulated through the motor nerve. Less twitch augmentation was observed in directly stimulated muscles, when comparing twitch tension-time integrals obtained by nerve stimulation. Gambierol slowed the rate of muscle action potential repolarization without affecting amplitude and overshoot, but triggered spontaneous and/or repetitive action potentials in skeletal muscle fibres. Further evidence is provided that gambierol at sub-micromolar concentrations blocks a fast inactivating outward K+ current that is responsible for action potential prolongation in Xenopus skeletal myocytes. It is suggested that gambierol through a selective action on VGPC prolongs the duration of action potentials, enhances the extent and time course of Ca2+ release from the sarcoplasmic reticulum, and increases twitch tension generation. (iv) Gambierol specifically inhibits VGPC without affecting calcium-dependent and ATP-sensitive K+ channels, and without affecting catecholamine release of foetal chromaffin cells in primary culture. At the neuromuscular junction, gambierol increases nerve terminal calcium levels after nerve stimulation and increases synchronous quantal ACh release, without affecting spontaneous quantal release. Gambierol reverses the effects of d-tubocurarine and of botulinium type-A toxin in vitro. In addition, gambierol increases delayed quantal ACh release. (v) µ-conopeptides are known to block VGSC. The µ-CnIIIC has been purified from Conus consors venom, and synthesized. It inhibits completely skeletal muscle contraction induced by nerve or muscle stimulation, as expected for this family of toxins. However, µ-CnIIIC also inhibits Na+ current in neuroblastoma cells, and in KEK-293 and Xenopus oocytes expressing muscle-type Nav1. 4 channels. µ-CnIIIC is about 10 times more potent to inhibit global action potentials in unmyelinated axon than in myelinated ones. Therefore, results show that µ-CnIIIC is active on both muscle-type and neuronal-type VGSC. All together, present results show the great diversity of mechanisms of action of neurotoxins isolated from aquatic organisms, and the interest in continuing their studies in order to understand their physio-pathological effects during intoxinations, as well as for developing new and original selective pharmacological agents and tools to study physiological processes.