Phytoextraction du plomb par les Pélargoniums odorants : interactions sol-plante et mise en place d'outils pour en comprendre l'hyperaccumulation

Lead phytoextraction by scented Pelargonium cultivars : soil-plant interactions and tool development for understanding lead hyperaccumulation

• Auteur / Autrice : Muhammad Arshad
• Direction : Jean Kallerhoff, Camille Dumat
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Ecologie (Biotechnologie Environnementale)
• Date : Soutenance le 10/07/2009
• Etablissement(s) : Toulouse, INPT
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences de l’univers, de l’environnement et de l’espace (Toulouse)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratoire Écologie fonctionnelle et environnement (Toulouse ; 2007-2023)

Mots clés

Mots clés libres

Phytoremediation

Pélargonium odorants

Pb

Hyperaccumulateur

Phyto-disponibilité

Spéciation

Cod

PH

Régénération

Transformation Génétique

Agrobacterium

Phytoremediation

Scented Pelargonium

Pb

Hyperaccumulators

Phytoavailability

Speciation

Doc

PH

Regeneration

Genetic transformation

Agrobacterium

Résumé

L'utilisation des plantes pour décontaminer les sols pollués par les métaux est une solution respectueuse de l'environnement. Mais le développement de cette technique à grande échelle est encore limité en raison de l'indisponibilité de plantes avec les caractéristiques souhaitées (hyperaccumulation, biomasse élevée et croissance rapide). Les objectifs de ce travail étaient d'évaluer le potentiel de plusieurs cultivars de Pélargonium odorants pour l'extraction du Pb au champ, étudier la disponibilité du plomb en relation avec l'activité rhizosphérique et développer un protocole de transformation génétique. Parmi les six cultivars de Pélargonium odorants testés au champ, trois : Attar of Roses, Clorinda et Atomic Snowflake ont accumulé plus de 1000 mg kg-1 Pb, avec une forte biomasse. Pendant les expérimentations en conditions contrôlées, Attar of roses (le cultivar hyperaccumulateur) acidifie sa rhizosphère et augmente la concentration en COD significativement plus par rapport Concolor Lace (le cultivar non hyperaccumulateur), sans doute en réponse à la pollution métallique. Les concentrations en plomb dans les deux cultivars sont corrélées avec l'extraction au CaCl2. Les analyses par EXAFS et ESEM-EDS ont montré que le plomb présent dans les racines était principalement sous forme de complexes organiques alors que les sulfates de plomb prédominent dans le sol. Parallèlement à ces essais, un protocole de transformation génétique a été mis au point en vue de mieux comprendre les processus biochimiques impliqués dans l'hyperaccumulation et la fonction des gènes, Le système de régénération optimisé se base sur la pré-culture d'explants sur un milieu contenant 10 μM TDZ + 1 mg L-1 de chacun de BAP et NAA suivie par l'enlèvement de TDZ du milieu de culture. La kanamycine et l'hygromycine se sont avérés être de bons marqueurs sélectifs pour le Pélargonium. Deux souches d'Agrobacterium, C58 et EHA105 contenant des vecteurs binaires avec des gènes marqueurs hpt et nptII ont été choisis pour des expériences de transformation. Ils ont également le gène codant uidA séquence du gène rapporteur. Après l'infection avec C58, 4 et 107 plantes enracinées sur hygromycine ont été obtenues pour Attar of Roses et Atomic Snowflake, respectivement. Parmi ces plantes enracinées, les quatre plantes d'Attar et 82 d'Atomic Snowflake ont exprimé le Gus dans les feuilles, pétioles, les tiges et les racines comme prévu avec une séquence sous contrôle du promoteur constitutif CaMV 35S. De 20 plantes qui expriment le Gus, 7 plantes se sont avérées être positives après criblage par PCR. Après infection par EHA105, 23 et 133 plantes enracinées ont été obtenues après sélection sur kanamycine, mais aucune n'a démontré d'activité GUS. Seule des expériences d'empreintes par Southern blotting permettront de corréler le nombre d'insertions et niveau de l'expression dans ces différents événements de transformation.

Metal removal from contaminated soils using plants can provide an environment friendly solution. However, its successful application on a large scale is still limited due to unavailability of plants with desired set of characteristics i.e. hyperaccumulation, high biomass and rapid growth. The objective of this work was to assess the potential of scented Pelargonium cultivars for lead (Pb) extraction under field conditions, plant induced rhizosphere changes, soil factors influencing availability of Pb and to develop an efficient genetic transformation protocol for the selected cultivars. Of the six scented Pelargonium cultivars field-tested, three cultivars (Attar of Roses, Clorinda and Atomic Snowflake) accumulated more than 1000 mg Pb kg-1 DW, with high biomass reaching up to 45 tons ha-1 y-1 dry matter. During assays in controlled conditions, Attar of roses (Pb hyperaccumulator) significantly acidified its rhizosphere and increased Dissolved Organic Carbon (DOC) concentration as compared to Concolor Lace (non-accumulator), probably due to enhanced exudation in response to the metal stress. Lead concentrations in both cultivars were best correlated with CaCl2 extracted Pb. Extended X-ray Absorption Fine Structure (EXAFS) and Environmental Scanning Electron Microscopy-Energy Dispersive x-ray Spectroscopy (ESEM-EDS) demonstrated that Pb was mainly complexed to organic acids within plant tissues whereas the dominant form in soil was PbSO4. Parallel to the soil-plant Pb transfer assays, a genetic transformation protocol was optimized in view of better understanding biochemical processes involved in lead hyperaccumulation and gene function, in the future. The best regeneration scheme was based on the pre-culture of explants on 10 μM TDZ (Thidiazuron) in addition to 1 mg L-1 each of N6-benzylaminopurine (BAP) and α- naphthaleneacetic acid (NAA), followed by removal of TDZ from the culture medium. Kanamycin and hygromycin proved to be efficient selectable markers for genetic transformation. Two Agrobacterium strains, C58 and EHA105 harboring binary vectors carrying the selectable marker genes hpt and nptII were chosen for transformation experiments. They also contained the uidA gene coding sequence as reporter gene. After infecting with C58, 4 and 107 rooted plants on hygromycin-containing medium were obtained for Attar and Atomic cultivars, respectively. The four Attar plants and 82 Atomic plants expressed Gus in leaves, petioles, stems and roots as expected with a sequence driven by the 35S constitutive promoter. Polymerase Chain Reaction (PCR) screening was performed on Gus positive plants and 2 and 20 plants of Attar and Atomic were screened as PCR positive, respectively. After infection with EHA105, 23 and 133 rooted plants were obtained on kanamycin selection medium but none of these expressed Gus. Southern hybridization patterns will enable to correlate gene copy numbers to expression levels in these different events. The optimized protocols could be used for understanding molecular mechanisms of Pb accumulation and improvement in phytoextraction technique.