Études structure-fonction de lectines de bactéries opportunistes

Structure-function studies of lectins from opportunistic bacteria

• Auteur / Autrice : Ondrej Sulak
• Direction : Anne Imberty, Michaela Wimmerová
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biochimie structurale et fonctionnelle
• Date : Soutenance en 2009
• Etablissement(s) : Université Joseph Fourier (Grenoble, Isère, France ; 1971-2015) en cotutelle avec Masarykova univerzita (Brno, République tchèque)
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale chimie et science du vivant (Grenoble ; 199.-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Centre de recherches sur les macromolécules végétales (Grenoble, Isère, France ; 1966-....)
• Partenaire(s) de recherche : Autre partenaire : Marie Curie fellowship association
• Jury : Président / Présidente : Hugues Lortat-Jacob
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Jaroslav Koča
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Mirjam Czjzek, Marek Šebela

Mots clés

Mots clés contrôlés

Radiocristallographie

Résonance plasmonique de surface

Calorimétrie

Fibrose

Bactéries pathogènes

Infections à Burkholderia

Infections à germes opportunistes

Cristallographie

Oligosaccharides

Burkholderia cepacia

Ralstonia solanacearum

Pseudomonas aeruginosa

Lectines

Mots clés libres

Ralstonia solanacearum

Burkholderia cenocepacia

Lectin

Pathogen

Cystic fibrosis

Oligosaccharides

Microcalorimetry

Surface plasmon resonance

Glycan array

Protein crystallisation

X-ray crystallography

Résumé

Les lectines sont des protéines capables de reconnaître des glucides complexes de manière spécifique et réversible sur des surfaces des cellules et des membranes cellulaires. Ce travail de thèse est centré sur l’étude des interactions entre des lectines produites par les bactéries pathogèniques burkholderia cenocepacia et ralstonia solanacearum et leurs ligands carbohydrates. Différents outils, tels que la cristallographie, la résonance plasmonique de surface, la microcalorimétrie de titration… ont été utilisés pour caractériser deux lectines. La bactérie ralstonia solanacearum, pathogène de plantes, produit trois lectines solubles, RSI, RS-III et RS20L. Ces lectines ont été précédemment cristallisées mais la caractérisation de RS20L n’est pas complète. Au cours de cette thèse, la production de RS20L recombinante a été optimisée et son comportement physicochimique analysé par 2D SDS-PAGE / MALDI-MS et DSC. Cependant tous les essais pour déterminer la spécificité et l’affinité de cette lectine se sont révélés infructueux et de nouvelles stratégies devront être développées. La deuxième partie de ce travail est consacrée à une lectine de la bactérie opportuniste burkholderia cenocepacia, responsable d’une forte mortalité pour les patients qui souffrent de la mucoviscidose ou de granulomatose chronique. La lectine BC2L-C est une protéine de 28 kDa, composée de deux domaines qui ont été clonés séparément, produits dans E. Coli et caractérisés. Le domaine C-terminal montre des similarités de séquences et de structure avec la lectine PA-IIL de Pseudomonas aeruginosa et a une forte affinité pour les oligosaccharides mannosylés. Le domaine N-terminal a aussi la faculté de lier des glucides avec une spécificité forte pour les oligosaccharides fucosylés tels que déterminants de groupe sanguin de type H ou Lewis. Le domaine N-terminal en complexe avec le selenio-methyl-fucoside cristallise dans une forme trimérique qui n’a pas été encore observée chez les lectines mais qui est très similaire au TNF-α ou au composant C1q du complément. La lectine BC2L-C représente donc une nouvelle superlectine avec deux domaines et leur spécificité

Lectins are carbohydrate-binding proteins of non-immune origin that bind specifically to complex carbohydrates. The presented Ph. D. Thesis is approaching the study of molecular mechanisms of interactions between lectins produced by pathogenic bacteria Burkholderia cenocepacia and Ralstonia solanacearum and their carbohydrate ligands. Cristallography, surface plasmon resonance, titration microcalorimetry and other tools were used for the characterisation of two lectins. The plant bacterial pathogen Ralstonia solanacearum produces three soluble lectins RSL, RS-IIL and RS20L. All of them have been previously studied but the characterisation of RS20L was not complete. During this thesis, the production of the RS20L lectin was optimised and its physicochemical behaviour analysed by 2D SDS-PAGE / MALDI-MS analysis and DSC. However, different assays for determining carbohydrate specificity and affinity were not successful and different strategies have to be designed. The second part of the thesis is devoted to a lectin from the human opportunistic pathogen Burkholderia cenocepacia, responsible of high mortality in patients with cystic fibrosis or chronic granulomatous diseases. The BC2L-C lectin is a 28 kDa protein composed of two distinct domains that were separately cloned and produced in E. Coli and characterised. The C-terminal domain shows sequence and structure similarity to the Pseudomonas aeruginosa lectin (PA-IIL) and recognises with high affinity D-mannosylated glycans. The N-terminal domain also displays sugar-binding ability with a strong preference for L-fucosylated oligosaccharides such as H-type and Lewis histo-blood group determinants. The N-terminal domain complexed with selenio-methyl-fucoside crystallises as a trimeric assembly that has not been observed for lectins earlier but that is highly similar to the TNF- α or C1q complement structures. The BC2L-C lectin is therefore a new superlectin with two different carbohydrate-biding domains and specificities