Étude des mécanismes génétiques de la résistance aux fluoroquinolones chez Legionella pneumophila

Characterization of the genetic mechanisms for fluoroquinolone resistance in Legionella pneumophilia

• Auteur / Autrice : Iyad Almahmoud
• Direction : Max Maurin, Élisabeth Kay
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Virologie, microbiologie, immunologie
• Date : Soutenance en 2009
• Etablissement(s) : Université Joseph Fourier (Grenoble ; 1971-2015)

Mots clés

Mots clés contrôlés

Topoisomérase II

Résistance aux antibiotiques

Fluoroquinolones

Maladie des légionnaires

Legionella pneumophila

Résumé

Les bactéries du genre Legionella causent la légionellose, pneumonie fatale dans 15% des cas. Les fluoroquinolones constituent le traitement le plus efficace, mais présentent le risque d'échecs thérapeutiques par sélection de mutants résistants. Pour étudier les mécanismes de résistance aux fluoroquinolones chez L. Pneumophila, nous avons utilisé une stratégie d'évolution expérimentale. Huit lignées ont été propagées in vitro à partir d'une souche de référence en présence de concentrations croissantes de moxifloxacine. Nous avons sélectionné des mutants indépendants présentant des niveaux faibles à très élevés de résistance (2 à 8192X la CMI), du fait de mutations successives dans les gènes codant les topoisomérases de type II. Les niveaux élevés de résistance nécessitent un ordre précis de mutations, la première affectant le codon 83 de gyrA. Nous avons élaboré une technique de PCR en temps réel pour tester la présence de cette mutation dans 385 isolats naturels et 78 prélèvements de patients, tous obtenus en phase aigüe de la maladie et avant traitement. Aucune mutation n'a été détectée. Notre méthode rend possible une surveillance de la résistance sans culture préalable, ce qui représente un avantage pour ces bactéries à croissance fastidieuse. Elle sera appliquée à des prélèvements de patients en échec thérapeutique. Nous avons testé l'effet des mutations de résistance sur la valeur sélective et la virulence de L. Pneumophila. Les mutants résistants montrent une diminution des deux phénotypes, compensable lors de cultures sans antibiotique, ce qui suggère une adaptation potentielle des mutants en milieu non sélectif et leur capacité à se maintenir en milieu naturel.

Legionella species cause legionellosis, an acute pneumonia with an 15% mortality rate. Fluoroquinolones are considered as first-line drugs, but treatment failures may occur due to selection of resistant mutants. We studied fluoroquinolone resistance mechanisms in L. Pneumophila by experimental evolution. Eight independent lineages were founded from a common ancestor that was serially propagated in the presence of increasing concentrations of moxifloxacin. We selected resistant mutant strains with low to high levels of resistance to moxifloxacin (2 to 8192 X MIC), due to mutations in the genes encoding type II topoisomerases. High level of resistance was associated to a specific order of mutations, the first one affecting the codon 83 of gyrA. We designed a real-time PCR-based assay to test the presence of this mutation in 385 natural isolates and 78 sputum samples obtained from legionellosis patients at the time of hospital admission and before antibiotic treatment. No mutation was found whatsoever but we can now use this tool to survey the prevalence of fluoroquinolone resistance by using a culture-independent approach, which provides a great advantage for microorganisms with fastidious growth. This will be applied to sputum samples from patients with treatment failures. We tested the impact of the detected resistance mutations on fitness and virulence of L. Pneumophila. Both phenotypes were negatively affected in resistant mutants, but compensation occurred after repeated growth in antibiotic-free medium, thereby suggesting the potential adaptation and maintenance of resistant mutants in natural environments.