Evolution dirigée d'un fragment d'anticorps à activité beta-lactamase

Directed evolution of an antibody fragment displaying a beta-lactamase activity

• Auteur / Autrice : Sylvie Bun
• Direction : Bérangère Bihan-Avalle, Alain Friboulet
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biotechnologie
• Date : Soutenance en 2009
• Etablissement(s) : Compiègne

Mots clés

Mots clés contrôlés

Bactériophages

Mutagénèse dirigée

Idiotypes

Abzymes

Inhibiteurs

β-lactamases

Mots clés libres

Anticorps catalytique

Fragment scFv

Idiotypie

Activité beta-lactamase

Evolution dirigée

Mutagénèse

Résumé

Les beta-lactamases et les Penicillin Proteins (PBPs) sont deux familles d’enzymes dont les rôles diffèrent mais pour lesquelles l’hypothèse d’une évolution à partir d’un gène ancestral commun est aujourd’hui largement admise. Néanmoins, le chemin évolutif entre ces deux familles de protéines n’est pas encore parfaitement élucidé. Les PBPs sont impliqués dans la synthèse et le remodelage du peptidoglycane constituant la paroi bactérienne. Les beta-lactamases sont responsables de certaines résistances bactériennes aux antibiotiques et suscitent à ce titre de nombreuses études afin de développer des inhibiteurs de cette activité enzymatique. Le but de cette étude est de faire évoluer un fragment d’anticorps anti-idiotypique à activité beta-lactamases, le scFv 9G4H9, afin d’approfondir l’étude structure-fonction d’une activité beta-lactamase et de comprendre les liens existants entre les beta-lactamases et les PBPs. L’évolution dirigée du scFv 9G4H9 présenté en surface de phage a permis d’isoler un mutant nommé H29, dont le résidu I181 a été muté en thréonine et dont l’activité est apparemment améliorée. La deuxième partie concerne la possibilité de réguler l’activité beta-lactamase par des peptides. Le peptide cycle Pep90 (CYHFLWPC), sélectionné sur l’anticorps 9G4H9, permet d’inhiber de manière compétitive l’activité de la beta-lactamase (Ki = 333µM). Les peptidomimétiques dérivés, nommés Pep90-WAza et Pep90-PD, conservent la capacité à inhiber l’enzyme avec des valeurs de Ki comparables à celle du peptide modèle. Ainsi, Pep90, sous sa forme naturelle ou dérivée, apparaît comme un modèle prometteur pour l’élaboration de molécules utilisables en antibiothérapie.

Beta-lactamases and Penicillin Binding Proteins (PBPs) are two enzymes families whose roles are different but for wich the hypothesis of an evolution from a common ancestral gene is now widely accepted. However, the evolutionary pathway between these two families of proteins is not yet fully elucidated. PBPs are involved in the synthesis and remodeling of the peptidoglycan composing bacterial cell wall. Beta-lactamases are responsible for certain bacterial resistance to antibiotics and raise as such numerous studies to develop inhibitors of this enzymatic activity. The purpose of this study is to force evolution of an anti-idiotypic antybody fragment endowed withi a beta-lactamase activity, scFv 9G4H9, in order to further study structure-function relationship of a beta-lactamase activity and to understand the linkage between beta-lactamases and PBPs. Directed evolution of phage displayed scFv 9G4H9, allowed to isolate a mutant named H29 which residue I181 was replaced by threonine. Its activity is apparently improved. The second part concerns the possibility of regulating the beta-lactamase activity by peptides. The cyclic peptide Pep90 (CYHFLWPC), selected on antibody 9G4H9, inhibits competitively the activity of beta-lactamase (Ki = 333 µM). The peptidomimetic derivatives, named Pep90-WAza and Pep90-PD retain capacity to inhibit the enzyme with similar Ki values compared to that of the peptide model. Thus, Pep90, in its natural form or derivative, appears as a promising model for the design of molecules for antibiotherapy application.