Viabilité et cultivabilité de L. Pneumophila : étude des mécanismes impliqués dans la récupération de l'aptitude à former des colonies

Viability and cultivability in L. Pneumophila : study of loss and recovery of the ability to form colonies

• Auteur / Autrice : Adrien Ducret
• Direction : Sam Dukan
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie
• Date : Soutenance en 2009
• Etablissement(s) : Aix-Marseille 2
• Ecole(s) doctorale(s) : École Doctorale Sciences de la vie et de la santé (Marseille)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratoire de Chimie bactérienne (LCB) (Marseille)

Mots clés

Mots clés contrôlés

Biocides

Maladie des légionnaires

Legionella pneumophila

Mots clés libres

Cultivabilité

Viabilité

Vbnc

Marqueurs de viabilité

Résumé

Legionella pneumophila est une bactérie pathogène responsable de la légionellose qui se transmet par voies aériennes à partir de sites industriels ou naturels générateurs d'aérosols (installation d'eau chaude sanitaire, tours aéroréfrigérantes,. . . ). Actuellement le dénombrement et l'isolement de L. Pneumophila sont régis par une norme basée sur l'utilisation de culture gélosés. Cependant, comme de très nombreuses bactéries Gram négatif, Legionella pneumophila serait capable de passer, en condition de carence ou de stress, dans un état viable mais non cultivable (VBNC). Au cours de cette étude, nou avons montré que les différents traitements biocides classiquement utilisés pour éradiquer L. Pneumophila dans les installations industrielles, induisaient la formation de cellules VBNC, déterminées à travers l'utilisation de marqueurs de viabilité et du milieu de culture de référence. Cependant, l'analyse fine des marqueurs de viabilité estimée pour chaque cellule viable détectée montre que celles-ci présentent une altération progressive des différents descripteurs de viabilité utilisés à mesure que la concentration en biocide augmente. En supposant dans un premier temps, que la perte de cultivabilité des cellules VBNC soit potentiellement due au stress oxydant généré lors que l'étalement, nous avons cherché à optimiser le milieu de référence. Au cours de cette étude de nombreux composés (antioxudants, métaboliques. . . ) ont ainsi été identifiés comme étant bénéfiques à la restauration de la cultivabilité d'une fonction de la population après un stress mais aussi, et de manière intéressante, au cours de la croissance. La co-existence de deux sous population cultivables (sur le milieu de référence ou supplémenté) dont la proportion relative évolue au cours du temps, soulève donc à ce jour, un certain nombre de questions quant à l'origine et à la pertinence physiologique de chacune des deux populations. Pour des raisons techniques, ces questions ne pourrons être résolues qu'à travers l'utilisation de méthodes centrées sur l'individu et non plus sur la réponse globale d'une population. Dans ce sens, nous avons initié le développement d'une chambre d'observation et d'un système de fluidique qui permet aujourd'hui un suivi en temps réel de la viabilité des cellules observé et de leur devenir au cours du temps ou au cours d'un stress tout en observant in fine leur capacité respective à former une colonie

Legionella pneumophila is the causative agent of Legionellosis transmitted by air from industrial or natural aerosols (installation of hot water, cooling towers. . . ) Currently standard procedure that uses the agar cultur media governs the detection and isolation of L. Pneumophila. However, like many Gram-negative bacteria, Legionella pneumophila is able to enter in a viable state but non culturable (VBNC) during starvation or stress conditions. In this study, we showed that the different treatment biocides traditionally used to eradicate. L. Pneumophila in industrial plants, induced the formation of VBNC cells, determined using viability markers and reference agar medium (BCYE). However, detailled analysis of the viability markers shows that they have a progressive detetioration of the viability of different descriptors used as the biocide concentration increases. Assuming initially that the loss of culturability of VBNC cells is potentially due to oxidative stress generated during spreading, we sought to optimize the reference medium. During the study many compounds (antioxidants, metabolic. . . ) have been identified as benefical to the restoration of culturability for a fraction of the population after stress but also, interestingly, during growth. The co-existence of two populations (culturable on the reference medium or the supplemented medium) with the relative proportion changes over time, raises to date, a number of questions about the origin and physiological relevance of each of the two populations. For technical reasons, these issues can be resolved only with methods focused on the individual rather than on the overall response of a population. In this sense, we initiated the development of an observation chamber and a fluidic system that now allows as realtime monitoring of cell viability observed and their evolution over time or during a stress while observing ultimately their respective ability to form a colony