Mise au point de tests ''preuve de principe'' pour l'étude des inhibiteurs de la Plk1 et caractérisation de la Plk1 en tant que cible dans le traitement des leucémies aigües myéloïdes

Plk1 inhibitors of assays in order to study Plk1 inhibitors and characterization of Plk1 as a target in acute myeloid leukemia

• Auteur / Autrice : Annelies Renner
• Direction : Bernard Payrastre, Christian Bailly
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Cancérologie
• Date : Soutenance en 2008
• Etablissement(s) : Toulouse 3

Mots clés

Mots clés contrôlés

Protéines kinases

Immunosuppresseurs

Cancérogenèse

Leucémie aigüe myéloïde

Mots clés libres

Polo-like kinase 1 (Plk1)

PBD, cycle cellulaire

Mitose

Cancer

Leucémie aiguë myéloïde (LAM)

MTOR

Clones inductibles

Multi-plex

Résumé

La Polo-like kinase1 (Plk1) est un régulateur mitotique majeur, surexprimé dans différents cancers et souvent associé à un mauvais pronostic. D'un point de vue expérimental, l'expression constitutive de la Plk1 dans des cellules NIH 3T3 entraîne leur transformation et leurs confère la capacité à former des tumeurs chez des souris athymiques. De plus, la déplétion de Plk1 dans des cellules cancéreuses induit souvent leur apoptose. Plk1 est donc une cible potentielle très étudiée dans le cadre des thérapies anti-cancéreuses. L'un des objectifs de ma thèse a été de générer des outils moléculaires et cellulaires afin de mettre au point des tests ''preuve de principe'' rendant compte de l'activité d'inhibiteurs de Plk1. La construction de ces outils avait également pour objectif de mieux appréhender le rôle de Plk1 dans les différentes étapes de la division cellulaire, et de rechercher de nouveaux substrats et partenaires de cette kinase. Des lignées cellulaires inductibles permettant l'expression de la Plk1 sauvage et de différents mutants (inactifs, suractivés) ont été construites. L'effet de l'induction de ces diverses formes de Plk1 sur la prolifération, la répartition des cellules dans le cycle et les substrats de la kinase a été étudié. Comme attendu, plus la protéine est active, plus l'effet sur ces paramètres est marqué. Divers inhibiteurs de Plk1 ont été testés sur ces modèles cellulaires avec, in fine, la mise au point de tests permettant d'évaluer rapidement et à haut débit l'efficacité de molécules inhibitrices. La technologie Luminex a été notamment mise à profit pour doser Plk1 et certains de ses substrats (phosphorylés ou non), représentatifs de l'activité de la kinase, à partir de lysats cellulaires. Cette approche permet d'évaluer l'effet d'inhibiteurs potentiels de Plk1 in cellulo par une série de dosages réalisés simultanément à partir d'extraits cellulaires. Les Leucémies Aiguës Myéloïdes (LAM) sont des hémopathies clonales liées à la transformation maligne d'une cellule souche hématopoïétique qui présente un blocage de maturation et une prolifération anarchique. Les mécanismes moléculaires impliqués dans la dérégulation du cycle cellulaire dans cette pathologie sont encore mal connus. L'un des objectifs de cette étude a été de caractériser le statut et le rôle de la Plk1 dans la physiopathologie des LAM, afin d'évaluer l'intérêt d'un traitement spécifique ciblant cette kinase dans cette pathologie. . .

Polo-like kinase 1, a major regulator of mitosis, is found overexpressed in many cancers and its overexpression correlates with a bad prognosis. Experimentally, the constitutive expression of Plk1 induces transformation of NIH3T3 cells and confer them the ability to initiate new tumours in athymic mice. In addition, Plk1 depletion in cancer cells induces apoptosis, suggesting that Plk1 may be a new pharmacological target in anticancer therapies. The first aim of my thesis was to generate molecular and cellular tools in order to characterize the activity of Plk1 inhibitors, evaluate the implication of Plk1 in different steps of cell division and to find new partners Plk1. We generated inducible cell lines allowing the expression of wild type and mutants' forms (inactivated, overactivated) of Plk1, and the analysis of their impact on growth, proliferation, cell cycle and also on known substrates of Plk1. As expected, the higher the activity of Plk1 is, the best its impact on these biological processes. We have tested on these inducible cell lines several inhibitors of Plk1, and developed an assay allowing a rapid and highly efficient evaluation of the effect of these inhibitors on the Plk1 pathway. The Luminex methodology was used on cell extracts in order to assess the activity of Plk1 on its downstream effectors. This methodology appears to be very efficient to analyse the effects of putative Plk1 inhibitors in cellulo. The second aim of my thesis was to analyse the status and role of Plk1 in a malignant hemopathy, Acute Myeloid Leukemia (AML). AML is a clonal hemopathy characterized by a block in differentiation and by an uncontrolled proliferation of immature leukemic cells. Molecular mechanisms involved in the dysregulation of cell cycle in AML are still poorly understood. We have characterized the expression and the role of Plk1 in AML cell lines and primary cells and analysed the consequences of a specific Plk1 inhibition in this pathology. . .