Mécanismes physiologiques de l'import d'ADN dans les mitochondries et perspectives pour la transfection mitochondriale

Physiological mechanisms underlying DNA import into mitochondria and prospects for mitochondrial transfection

• Auteur / Autrice : Noha Ibrahim
• Direction : André Dietrich
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie cellulaire et moléculaire
• Date : Soutenance en 2008
• Etablissement(s) : Université Louis Pasteur (Strasbourg) (1971-2008)
• Partenaire(s) de recherche : Autre partenaire : CITI - Centre d'Innovation en Télécommunications et Intégration de services (Lyon, INSA)

Résumé

Les mitochondries assurent des fonctions vitales dans la production d’énergie, les processus d’oxydo-réduction et le métabolisme des cellules eucaryotes. Ces organites possèdent leur propre système génétique. Le vieillissement pourrait être lié à leur dysfonctionnement progressif et les mutations dans leur génome sont à l’origine de nombreuses maladies dégénératives actuellement incurables. Ces pathologies neuromusculaires, qui comprennent par exemple les syndromes MERRF (''myoclonus epilepsy with ragged-red fibers'') et MELAS (''mitochondrial encephalomyopathy with lactic acidosis and stroke-like episodes''), peuvent être extrêmement invalidantes et laissent pour l’instant les cliniciens démunis. Chez les plantes, les mutations non létales de l’ADN mitochondrial (ADNmt) se traduisent principalement par la stérilité mâle cytoplasmique, qui est très utilisée en agronomie. La biogenèse des mitochondries nécessite l’import de mille à deux mille protéines codées par le génome nucléaire mais le système génétique mitochondrial doit fournir un certain nombre de polypeptides qui sont essentiels pour la survie de la cellule car ce sont des composants de la chaîne respiratoire. Le maintien, l’intégrité et l’expression efficace du génome mitochondrial sont donc fondamentaux pour les organismes eucaryotes. La compréhension du système génétique mitochondrial est cependant très parcellaire et ses dysfonctionnements pathologiques dus à des mutations dans l'ADNmt ne peuvent pas être complémentés. Ceci est dû dans une large mesure à l’impossibilité de transformer génétiquement les mitochondries des plantes et des mammifères par des méthodes conventionnelles de type biolistique. Il est donc primordial de développer de nouvelles approches permettant de modifier l’information et l’expression génétique dans les mitochondries. Seules les mitochondries de la levure Saccharomyces cerevisiae et de la microalgue Chlamydomonas reinhardtii peuvent être transformées à l’heure actuelle in vivo1,2. L’électroporation a permis d’introduire puis de transcrire de l’ADN dans des mitochondries isolées de trypanosomatides (Leishmania tarentolae et Trypanosoma brucei)3 et de blé (Triticum aestivum)4. L’incorporation d'ADN par électroporation a également été décrite pour les mitochondries de souris (Mus musculus)5. La transcription de l'ADN ainsi incorporé a été revendiquée6 mais reste controversée. L’utilisation de chimères entre l’ADN et un peptide d’adressage mitochondrial est à l’étude7. La transfection de mitochondries de souris isolées par conjugaison avec des bactéries a également été décrite8. Aucune de ces techniques artificielles n’a donné lieu au développement d’une stratégie de transformation des mitochondries dans les cellules animales ou végétales. Dans ce contexte, notre laboratoire a montré, en collaboration avec l’équipe de Yuri Konstantinov (Institut de Physiologie et de Biochimie des Plantes de Sibérie, Irkoutsk, Russie), que les mitochondries végétales isolées ont la capacité d'importer de façon active de l'ADN double brin et que l'ADN ainsi incorporé peut être transcrit dans les organelles9. L’import est indépendant de la séquence et l’ADN incorporé est stable dans les mitochondries. Le processus a depuis été établi avec des mitochondries isolées de différentes espèces végétales. Ces résultats ont mis en évidence un nouveau mécanisme de transport mitochondrial qui a les caractéristiques d’un phénomène physiologique. Une approche similaire a démontré l’import d’ADN dans les mitochondries isolées de la levure S. Cerevisiae. Dans ce contexte, notre laboratoire a montré, en collaboration avec l’équipe de Yuri Konstantinov (Institut de Physiologie et de Biochimie des Plantes de Sibérie, Irkoutsk, Russie), que les mitochondries végétales isolées ont la capacité d'importer de façon active de l'ADN double brin et que l'ADN ainsi incorporé peut être transcrit dans les organelles9. L’import est indépendant de la séquence et l’ADN incorporé est stable dans les mitochondries. Le processus a depuis été établi avec des mitochondries isolées de différentes espèces végétales. Ces résultats ont mis en évidence un nouveau mécanisme de transport mitochondrial qui a les caractéristiques d’un phénomène physiologique. Une approche similaire a démontré l’import d’ADN dans les mitochondries isolées de la levure S. Cerevisiae.

There are considerable gaps in the understanding of the mitochondrial genetic systems and dysfunctions related to mutations in the mitochondrial DNA cannot be complemented. This is mainly due to the fact that conventional transformation of mitochondria has been unsuccessful for plants and mammals and is currently possible only for the yeast Saccharomyces cerevisiae and the green alga Chlamydomonas reinhardtii. No gene therapy strategy has thus been developed for genetic diseases due to mitochondrial DNA mutations. However, in collaboration with the groups of Y. Konstantinov (Irkutsk, Russia) and R. N. Lightowlers (Newcastle, UK), our laboratory has shown that isolated plant [1], mammalian [2] and yeast mitochondria have a natural potential to incorporate, repair and express foreign DNA. To understand, optimize and potentially use this process for mitochondrial transfection in vivo, I studied the import mechanism through biochemical, physiological and proteomic approaches. Some genetic analyses using yeast mutants were run in parallel in our laboratory. The voltage-dependent anion channel (VDAC) was identified as the putative translocator through the outer membrane. In the case of plant mitochondria, DNA import seems to follow nucleotide transport pathways to cross the inner membrane and to be concomitant with phosphate uptake and proton exchange. Nucleotide carriers also seem to play a role in DNA translocation into yeast organelles. Effectors and inhibitors have a limited effect on DNA transport into mammalian mitochondria, so that it is still difficult to figure out how the DNA crosses the inner membrane in this case. To directly identify the import complex, we designed DNA substrates with a bulky end which get stuck in the membranes during translocation. Using this system, we proved that mitochondrial protein import is not influenced when the DNA import channel is blocked, indicating that the two pathways do not overlap. On the contrary, it seems that DNA import might have some step(s) in common with another natural mitochondrial transport process: the import of cytosolic transfer RNAs (tRNAs) which compensates for the lack of a number of tRNA genes in plant organelle genomes [3]. To further characterise DNA translocation through the outer membrane and look for putative ''receptors'', we have analysed cyanine labeling of intact plant mitochondria in DNA import conditions. Proteins masked by the DNA were subsequently identified by mass spectrometry. However, cyanines turned out to be able to cross the outer membrane and label proteins accessible in the intermembrane space. Differential labeling nevertheless highlighted again the VDAC isoforms and two potential ''receptor'' candidates: the precursor of the ATP synthase beta subunit, which is present on the outer membrane, and a complex I subunit of unknown function. Mitochondrial transformation will need the maintenance of the imported DNA in the organelles. We showed that uracil-containing DNA imported into plant mitochondria can be specifically repaired in organello through a base excision repair mechanism. The first step in such a pathway is carried out by a DNA glycosylase. Through in vivo and in vitro assays, we demonstrated that uracil DNA glycosylase and 8-oxo guanine DNA glycosylase are indeed targeted to mitochondria in plants. A ''rolling circle'' replication pathway is likely to exist in plant mitochondria and might enable to maintain a properly designed DNA sequence upon import. However, this will require circular DNA, whereas only linear DNA is a substrate for import. We have thus analysed the in organello circularization of a linear DNA imported into plant mitochondria. Concerning the in vivo relevance of the DNA import process, we have hypothesized that it might be the basis for paternal transmission of an 11. 6 kb mitochondrial plasmid in Brassica napus [4]. We showed that this plasmid is indeed efficiently imported into isolated Brassica mitochondria. The import efficiency is due to the inverted repeats present at the ends of the plasmid and these sequences will be included in custom substrates for in vivo assays. To progress towards mitochondrial transformation in vivo, we started a new approach using DQAsomes as potential intracellular vehicles [5]. These vesicles have the property of binding DNA. They can cross the plasma membrane of mammalian cells and subsequently show a mitochondrial tropism. When contacting mitochondria, they release their DNA cargo [5], which we expect then to be imported into the organellles through the mechanism that we have studied in vitro. So far, my experiments show that DNA presented to isolated plant mitochondria by DQAsomes is imported. In vivo mitochondrial transfection assays will now be developed on this basis in plant and human cells using reporter constructs.