Identificación de genes de RNAs pequeños nucleolares C/D (C/D snoRNAs) y caracterización du su mecanismo de expresión en Arabidopsis thaliana

Identification of the C/D small nucleolar RNA (C/D snoRNA) genes and characterization of their expression mechanism in Arabidopsis thaliana

• Auteur / Autrice : Ingrid Johanna Letelier Suárez
• Direction : Manuel Echeverria
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences de la vie. Biologie intégrative des plantes
• Date : Soutenance en 2008
• Etablissement(s) : Perpignan en cotutelle avec Pontificia universidad católica de Chile (Santiago de Chile)
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Énergie environnement (Perpignan ; 1999-....)

Mots clés

Mots clés contrôlés

ARN

Arabidopsis thaliana

Méthylation

Nucléotides

Ribosomes

Acides nucléiques

Résumé

Les C/D snoRNAs sont des guides de methylation sur le 2’-O-ribose des RNAs. Ils se caractérisent par une structure secondaire qui se forme par appariement de deux séquences répétées inversées terminales. De plus ces C/D snoRNAs présentent des séquences conservées correspondantes aux boîtes C (RUGAUGA) et D (CUGA) localisé aux extrémités 5’ et 2’ respectivement. Dans certains cas on trouve aussi des boîtes internes C’ et D’ qui sont moins conservées. Chaque C/D snoRNA possède une séquence guide de methylation juste en amont de la boîte D ou D’. Cette séquence guide est complémentaire au RNA cible dirige la methylation spécifique du 5’ nucléotide situé en amont de la boîte D. Les snoRNAs agissent comme des guides de methylation au sein d’un complexe C/D snoRNP formé par l’association avec quatre protéines nucléolaires conservées : la fibrillarine, Nop56p, Nop58p et Snu13p. La fibrillarine est la RNA methylase qui utilise le SAM comme donneur de groupements methyls. La formation du complexe C/D snoRNP est initié par l’interaction de Snu13p avec les boîtes C/D qui forment une structure appellé de type k-turn. En plus de ces quatre protéines le C/D snoRNP interagit de manière transitoire avec les protéines p50 et p55. Ces protéines sont conservées phylogénétiquement et présentent une activité hélicase qui serait nécessaire pour la biogenèse des snoRNPs dans le nucléoplasme. Les gènes de C/D snoRNAs présentent une grande diversité dans leur organisation génomique selon les différents organismes. Essentiellement on trouve des snoRNAs codés par des gènes individuels transcrits à partir de leur propre promoteurs, des snoRNAs introniques localisés dans les introns de gènes codant des protéines ou des gènes polycistroniques. Chez les animaux la grande majorité des snoRNAs sont de type introniques mais il n‘y a pas de gènes polycistroniques. Chez la levure la majorité des C/D snoRNAs sont codés par des gènes individuels, mais il y a aussi quelques introniques et 4 gènes polycistroniques. Chez les plantes les trois types de gènes existent mais la grande majorité sont des gènes polycistroniques. Ceux-ci sont pour la plupart des gènes indépendants transcrits à partir de leur propre promoteur mais il existe aussi des polycistron qui se trouvent dans les introns de gènes codants pour des protéines

The small nucleolar RNAs belong to a large family of small non-coding RNAs, found in eukaryotes and archaea, that participates in the processing and modification of other RNAs. In the model plant Arabidopsis, more than 180 C/D snoRNA genes have been identified. In spite of the large number of genes identified, information about of the regulation of C/D snoRNAs expression is still scarce. The general aim of this thesis is to contribute to the knowledge about organization and expression of C/D snoRNA genes in Arabidopsis thaliana. For this, we proposed as specific aims to identify C/D snoRNA genes in the Arabidopsis genome and to characterize their expression mechanism. In this thesis we obtained a cDNA library of small RNAs, from which we identified 19 C/D snoRNAs that have rRNAs as target RNA. For a group of these genes we determined that stress treatments do not alter their expression. Furthermore, in this work we identified 23 new C/D snoRNA genes by analysis of the genomic context of C/D snoRNA genes previously identified, and we determined that these C/D snoRNAs have an unknown RNA as a target. From genes identified in the cDNA library and obtained from the snoRNA database, we selected 5 C/D snoRNA genes, snoR9-2, snoR10-2, snoR102-1, snoR108-1 and snoR201-1. These genes are localized in intergenic regions of the Arabidopsis genome, being therefore from independent expression. We detected and characterized their transcripts, by using primer extension, RT-PCR and 5’-3’ RLM-RACE. We determined that these genes are expressed as a monocistronic precursor, for snoR108-1, and as dicistronic precursors, for snoR9-2/snoR10-2 and snoR201-1/snoR102-1. These precursors show modifications such as a CAP in their 5’ end and a poli-adenilated tail in their 3’ end, suggesting that they are transcribed by the RNA polimerase II. Furthermore, we determined the transcription start site for the 3 precursors and we defined a putative promoter sequence, with the aim to identify promoter elements that could guide their expression. In the promoter of the 28 C/D pre-snoRNA analyzed we identify three associations of promoter elements: TATA/USE, TATA/SEE and TATA/GCCCR/TELO. We selected the snoR9-2/snoR10-2 promoter, as a model for the functional analysis of the elements TATA/GCCCR/TELO. For functional analysis of the elements found in the promoter of the snoR9-2/snoR10-2 precursor, we generated a C/D snoRNA reporter gene and evaluated the in vivo function of the promoter in a wt version and in 4 mutated versions, by using semi-quantitave RT-PCR. Results obtained in this thesis give us valuable information about the mechanisms involved in the expression of independent C/D snoRNA genes