Modélisation de la réponse impulsionnelle pour la détection de particules en microscopie par fluorescence

Point spread function model for spot detection in fluorescent microscopy

• Auteur / Autrice : Elodie Dusch
• Direction : Nicole Vincent
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Informatique. Traitement des images
• Date : Soutenance en 2008
• Etablissement(s) : Paris 5

Mots clés

Mots clés contrôlés

Microscopie de fluorescence

Microscopie confocale

Résumé

La réponse impulsionnelle d'un microscope, appelée Point Spread Function, crée un flou et une déformation des objets sur les images de fluorescence. Une connaissance précise de cette fonction peut permettre de corriger ce phénomène, ou encore de donner un a priori sur la taille des objets recherchés dans l'image. En effet, sous la supposition que les particules biologiques fluorescentes peuvent être assimilées à des impulsions lumineuses, l'image de ces particules sera alors exactement cette PSF. Dans un premier temps, nous nous intéressons à la modélisation de la réponse impulsionnelle en microscopie par fluorescence. Afin d'obtenir un modèle analytique, nous étudions la diffraction des ondes dans un système optique parfait. Nous proposons un modèle analytique 3D de la PSF d'un microscope confocal à balayage par ligne en nous basant sur la théorie scalaire de Debye. Ce microscope, dont le fonctionnement peut être comparé à un microscope à champ large suivant la direction de la ligne et un microscope confocal classique suivant la direction perpendiculaire, possède une PSF asymétrique dans le plan focal. La modélisation proposée comprend un modèle asymétrique ainsi qu'une approximation gaussienne de ce modèle. Une comparaison de ces deux représentations est réalisée sur une vérité terrain. Dans un deuxième temps, nous utilisons ces modèles pour la détection 3D de particules fluorescentes. Nous proposons une méthode de détection basée sur la courbure locale, combinée à une modélisation statistique de la formation de l'image afin d'estimer les positions sous-voxelliques des particules détectées. Cette modélisation prend en compte les perturbations affectant l'image et l'approximation analytique de la réponse impulsionnelle. De plus, nous étudions l'influence de la modélisation analytique et de son approximation gaussienne sur la détection de particules sous la résolution optique. Enfin, nous présentons des applications concrètes de la méthode à des problématiques biologiques, réalistes en collaboration avec d'autres équipes de l'Institut Pasteur de Corée.

In fluorescent Microscopy, the impulse response also called Point Spread Function (PSF) creates a blur and a deformation of imaged objects. Accurate model PSF allows to correct this phenomenon and also to define a priori on objet size. Indeed, base on the assumption that fluorescent particles are defined as impulse, biological fluorescent spot can be characterized by PSF. In the first part of this work, we focus on the modelization of fluorescent microscopy PSF. In order to obtain an analytical model, we study the light diffraction theory in perfect optical system. We introduce a 3D analytical model of fluorescent line-scanning confocal microscope PSF using the scalar Debye diffraction integral. This microscope can be considered as widefield microscope in the direction of the line illumination and as point-scanning confocal microscope in perpendicular direction, which yields an asymmetrical PSF in the focal plane. Based on our asymmetric model, we propose also a Gaussian approximation of the PSF. Both models are compared to a ground truth. In the second part, we use these models to detect 3D fluorescent particles. We propose a detection method based on local curvature, combined to a statistical representation of image formation in order to estimate the subvoxel localizations of the detected particles. This representation takes into account noise and PSF analytical models. Moreover, we study the effect of inaccurate PSF approximation on sub-resolution spot detections. Finally, we present practical applications of the method to biological problems, performed in collaboration with other teams of Institut Pasteur Korea