Etude du sous-site S1 de l'aminopeptidase A par modélisation moléculaire et mutagenèse dirigée. Exploration de la spécificité de substrat de cette enzyme

Study of the S1 subsite of APA by molecular modelling and site directed mutagenesis studies. New insight into APA substrate specificity

• Auteur / Autrice : Cédric Claperon
• Direction : Catherine Llorens-Cortes
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biochimie. Biologie moléculaire et cellulaire
• Date : Soutenance en 2008
• Etablissement(s) : Paris 5
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale du Médicament (....-2009Paris)
• Partenaire(s) de recherche : Autre partenaire : Université Paris Descartes. Faculté de pharmacie de Paris (....-2019)

Mots clés

Mots clés contrôlés

Système rénine-angiotensine

Mutagénèse dirigée

Molécules -- Modèles

Aminopeptidase A

Résumé

L’aminopeptidase A est une glycoprotéine homodimérique intégrale de type II appartenant à la famille des aminopeptidases monozincs. Elle possède deux caractéristiques : elle est activée par le calcium et présente une spécificité de substrat pour les résidus N-terminaux acides qui devient stricte en présence de calcium. L’utilisation d’inhibiteurs spécifiques et sélectifs de l’APA a permis de démontrer que cette enzyme est impliquée in vivo dans la conversion de l’angiotensine II cérébrale en angiotensine III. L’APA cérébrale se présente donc comme une cible thérapeutique potentielle pour le traitement de l’hypertension. Ainsi, la conception de composés capables de franchir la barrière hémato-encéphalique, d’inhiber dans le cerveau l’APA et de bloquer la conversion de l’angiotensine II en angiotensine III, pourraient constituer une nouvelle classe d’antihypertenseurs à action centrale. Afin de développer de tels composés, l’étude de l’organisation du site actif de l’APA a été entreprise. L’introduction d’un atome de calcium dans le modèle 3D a permis de visualiser une poche hydrophile, dans laquelle l’atome de calcium est lié par l’Asp-213 et l’Asp-218. L’implication de ces résidus dans la liaison du calcium et dans la spécificité de substrat de l’APA a été vérifiée par des expériences de mutagénèse dirigée. L’analyse du modèle nous a permis de visualiser, au sein du sous site S1, un autre résidu, la Thr-348, qui semble impliquer dans la spécificité de substrat pour les résidus N-terminaux acide de l’APA. La validation du rôle de la Thr-348 a été effectuée par mutagénèse dirigée

Aminopeptidase A is a type II integral membrane-bound protease belonging to the zinc metalloprotease family, the zincins. APA pocesses two characteristics: It contains a calcium ion that increases its enzymatic activity and specifically cleaves N-terminal acid residues, that is increased in the presence of calcium. In-vivo, APA converts brain angiotensin II to angiotensin III. However, angiotensin III is one of the effector peptides of the brain renin-angiotensin system and exerts a tonic stimulatory action on the central control of blood pressure. Central inhibition of APA results in a large decrease in arterial blood pressure in spontaneously hypertensive rats, suggesting that APA might constitute a putative therapeutic target for the treatment of hypertension. Introduction of a calcium atom in the 3D model allowed us to visualized an hydrophilic pocket, in which the calcium atom in bound to Asp-213 and Asp-218. The implication of these residues in calcium binding and substrate specificity was studied by site directed mutagenesis studies. The analysis of the 3D model revealed Thr-348, which seems to be implicated in APA substrate specificity. The role of this residue was demonstrated by site directed mutagenesis studies.