Signalisation hypoxique : le rôle de BNIP3 dans la prolifération et l'autophagy

Hypoxic signaling : the role of BNIP3 in proliferation and autophagy

• Auteur / Autrice : Raquel Garcia-Medina
• Direction : Jacques Pouysségur
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie cellulaire et moléculaire
• Date : Soutenance en 2008
• Etablissement(s) : Nice
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences de la vie et de la santé (Nice ; 1992-....)

Mots clés

Mots clés contrôlés

MAP kinase

Anoxie

Mots clés libres

Autophagie

Résumé

Le développement des tumeurs solides est souvent accompagné de l’apparition de régions hypoxiques. Les cellules tumorales s’adaptent rapidement à ce nouveau microenvironnement en favorisant la stabilisation et l’accumulation du facteur de transcription HIF-1a (Hypoxia Inducible Factor-1a). HIF-1a active un programme complexe d’expression génique qui en régulant l’homéostasie de l’oxygène, le métabolisme cellulaire, le pH ou encore l’invasion, permet la survie et la continuation du développement de la tumeur. La fonction dans le développement tumoral de certains gènes induits par l’hypoxie et HIF-1a, tel que BNIP3 (Bcl2/Adenovirus E1B 19 kDa interacting protein 3) et BNIP3L (Bcl2/Adenovirus E1B 19 kDa interacting protein 3-Like), reste cependant aujourd’hui inconnue. BNIP3 et BNIP3L sont membres de la sous-famille dite "BH3-only" appartenant à la famille des protéines de type Bcl-2. Certaines protéines "BH3-only" antagonisent par hétérodimérisation l’activité de facteurs anti-apoptotiques tels que Bcl-2 et Bcl-Xl et ont ainsi été montrées capables, dans certains contextes, d’induire l’apoptose. BNIP3 est surexprimé dans les cancers du sein et dans certains types de cancer du poumon (non small cell lung cancer). En revanche, dans une grande variété d’autres cancers comme les cancers du pancréas, hématopoïétiques, colorectaux ou gastriques, l’expression de BNIP3 est inhibée, et plusieurs études cliniques ont démontré une corrélation inverse entre l’expression de BNIP3 et la prolifération ainsi que l’agressivité de la tumeur. Malgré ces observations, la fonction précise de BNIP3 dans les cellules cancéreuses reste à élucider. L’objectif de mon travail de recherche est donc de mieux comprendre le rôle de BNIP3 dans le contexte hypoxique et tumoral et en particulier, d’étudier sa possible implication dans le contrôle de la survie cellulaire. De façon inattendue, nos résultats ont montré que l’expression de BNIP3 induite par l’hypoxie (1 % et 0. 1 % O2) dans les lignées tumorales BE et LS174 (carcinomes du colon) et MCF7 (cancer du sein), n’est jamais associée à une induction de la mort cellulaire in vitro. En réalité, nos résultats indiquent que l’hypoxie entraîne un ralentissement de la prolifération cellulaire et que ce ralentissement est dépendent de l’expression de BNIP3. En effet, d’une part, nous avons montré in vitro et in vivo que l’ablation de l’expression de BNIP3 (siRNAs et shRNAs) supprime le ralentissement de la prolifération induit par l’hypoxie. Et à l’opposé, la surexpression ectopique de BNIP3 dans des cellules en normoxie (20 % O2) est suffisante pour réduire la prolifération au niveau de la prolifération des cellules en hypoxie. Nous avons ensuite montré que BNIP3 contrôle la prolifération cellulaire en agissant sur la voie de signalisation Erk-MAPK, en régulant l’organisation et la dynamique du cycle cellulaire et en particulier en interférant avec la transition G1/S par rallongement de la phase G1. Nos résultats ont montré que l'induction de BNIP3 et de BNIP3L contribue à la survie de cellules en induisant autophagie. L’invalidation combinée de BNIP3 et de BNIP3L a supprimé l’autophagie induite par l’hypoxie. En second lieu, l'expression ectopique de BNIP3 et de BNIP3L en normoxie active l’autophagie. Nous proposons un modèle dans lequel les BH3-domains atypiques de BNIP3/BNIP3L hypoxie-induit ont été désignée pour perturber le complexe Beclin1-Bcl2 et induire ainsi l’autophagie. Notre hypothèse est que cette diminution de la prolifération induite par BNIP3 et l’activation de l’autophagie induite par BNIP3 et BNIP3L pourraient faire partie d’une réponse adaptative induite par HIF-1a permettant la survie cellulaire et le développement pérenne de la tumeur en condition de stress hypoxique (en modérant les besoins en oxygène/énergie de la tumeur).

As solid tumors grow the vascular network becomes insufficient for nutrient delivery and oxygen demand. The cells’ proximity to existing blood vessels leads to tumors characterized by areas of high oxygen tension interspersed with areas of relative hypoxia. Tumor cells respond by inducing and stabilizing the hypoxia-inducible factor 1 (HIF-1). HIF-1 regulates a complex gene expression network involved in the induction of angiogenesis, anaerobic metabolism, pHi regulation, migration and invasion, but also by decreasing tumor proliferation. The pathophysiological consequences and underlying molecular mechanisms of the HIF-dependent adaptation to hypoxia and HIF-dependent gene expression are far for being fully characterized. Two of these genes are the hypoxia-inducible pro-apoptotic molecule, Bcl-2/adenovirus E1B 19 KDa interacting protein 3 (BNIP3) and Bcl2/adenovirus E1B 19 kDa interacting protein 3-Like (BNIPL). BNIP3 and BNIP3L are part of the BH3-only Bcl-2 family. The members of this subgroup are characterized as pro-apoptotic and subsequently many investigations have focused on the role of BNIP3 in apoptosis. Some researchers have identified BNIP3 as a positive regulator of autophagy by promoting autophagosome formation and have suggested that this might be the mechanism by which BNIP3 promotes cell death. Nevertheless, many groups have been unable to see an impact of BNIP3 on cell death. In this study, we investigated the role of BNIP3 in normal and cancerous cells under hypoxic conditions in vitro and in vivo. We report that hypoxia-induced BNIP3 decreases colon carcinoma tumor proliferation as much as 70% in mice. Extracts from BNIP3-silenced tumors displayed a significantly higher level in ERK phosphorylation than control tumors. Hypoxia-induced or forced over-expression of BNIP3 in cultured hamster fibroblast (CCL39) and human colon carcinoma cells (BE) resulted in a significant decreased in active ERK, accumulation of the cdk inhibitor p27 with a consequent increase in the length of G1-phase and a significant decrease in cell proliferation. Conversely, knocking down of BNIP3 expression was sufficient to prevent the hypoxia-induced decrease in ERK activity and maintain normal cell proliferation. The BNIP3-dependent decrease in ERK activation was associated with increased MAPK phosphatase activity in vitro and higher dual specificity phosphatases (DUSPs) mRNAs in vivo. These studies establish the physiological significance of BNIP3 activity and begin to delineate a hypoxia-induced BNIP3 signaling pathway that acts through ERK regulation. Furthermore, we have been able to identify HIF-1-induced BNIP3L, which together with BNIP3, activates the autophagy process. As BNIP3L induction is observed to more extreme hypoxic conditions (0. 1%) it might relay the action of BNIP3 induced as early as 3% oxygen. First, while siRNA mediated ablation of either BNIP3 or BNIP3L has little effect on autophagy, combined silencing of these two HIF targets suppressed hypoxia-mediated autophagy. Second, ectopic expression of both BNIP3 and BNIP3L in normoxia activates autophagy. Third, 20-mer BH3-peptides of BNIP3 or BNIP3L were found to be sufficient to initiate autophagy in normoxia. Thus we propose a model in which the atypical BH3-domains of hypoxia-induced BNIP3/BNIP3L have been ‘designed’ to induce autophagy by disrupting the Beclin1-Bcl-2 complex without inducing cell death. Based on these results, we propose that hypoxia-induced BNIP3 participates in the general HIF-induced adaptive mechanism leading to tumor cell survival through the attenuation of the rate of cell proliferation decreasing ATP demand but also through the activation and regulation of autophagy in response to nutriment availability.