Explorer les voies de l’ARN interférence par initiation in planta pour dévoiler la fonction des gènes chez le riz (Oryza sativa L. ) et le cacaoyer (Theobroma cacao L. )

Exploring the paths of RNA interference induced in planta to unravel gene function in rice (Oryza sativa L. ) and cocoa (Theobroma cacao L. )

• Auteur / Autrice : Aurélie Andrieu
• Direction : Emmanuel Guiderdoni
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biochimie et biologie moléculaire
• Date : Soutenance en 2008
• Etablissement(s) : Montpellier 2

Mots clés

Mots clés contrôlés

Cacaoyer

Riz

Génétique végétale

Mots clés libres

Agro-infection

ARNi

Oryza sativa

Theobroma cacao

Expression transitoire

Résumé

Découvrir la fonction de l'ensemble des gènes végétaux est devenue une priorité depuis l'avènement des méthodes récentes de séquençage. Outre le nombre sans cesse croissant de génomes entièrement séquencés, à l'image de celui du riz, le nombre de séquences exprimées disponibles, ADNc et EST, est lui aussi en augmentation constante. C'est notamment le cas pour le cacaoyer (Theobroma cacao L. ) à travers un projet de séquençage d'EST réalisé au CIRAD Montpellier (Argout et al. , 2008), qui a permis de générer 149 650 ESTs. L'analyse bioinformatique de ces séquences a permis de repérer plusieurs gènes candidats potentiellement impliqués dans la résistance aux pathogènes, ou encore dans la qualité de la fève. La masse de données issue de ces programmes de séquençage nécessite maintenant de pouvoir disposer de méthodes efficaces à haut débit pour l'analyse fonctionnelle des gènes identifiés. Plusieurs techniques sont actuellement utilisées avec succès pour déterminer la fonction des gènes chez les plantes, mais la plupart d'entres elles impliquent l'utilisation de la transformation génétique stable, à l'image de la technologie d'inactivation de l'expression des gènes basée sur l'ARN interférence. Cette technique est couramment utilisée en génomique fonctionnelle car elle permet d'analyser avec efficacité et de manière ciblée la fonction des gènes. Ces travaux de thèse avaient pour objectif de développer un nouvel outil de génomique fonctionnelle permettant d'étudier la fonction des gènes avec efficacité et rapidité, sans avoir recours à la transformation génétique stable, en adaptant la technique d'agroinfection in planta pour initier et propager le mécanisme de l'ARNi dans la plante. La première étape de ces recherches a consisté à mettre au point une méthode d'expression transitoire de gènes dans les feuilles de riz et de cacaoyer par agro-infection. Si l'agro-infection in planta de cellules de feuilles de cacaoyer a été relativement aisée à obtenir en adaptant à cet arbre la méthode d'agro-infiltration de N. Benthamiana, aucune technique équivalente n'existait pour les céréales. L'agro-infection in planta du riz a donc nécessité de développer un protocole original, efficace et reproductible. Une fois la technique d'expression transitoire de gène validée pour ces deux espèces, des expériences d'extinction de gènes ciblées par ARNi ont été effectuées pour trois gènes endogènes pin1, chs et slr1, ainsi qu'un transgène gus pour le riz, et pour trois endogènes pin1, chs et pds pour le cacaoyer. Pour tous les gènes ciblés, il a été possible d'induire l'ARNi dans les cellules végétales. Après son initiation in planta, l'ARN interférence se maintient dans les tissus agro-infectés, ce qui conduit à une diffusion passive des siRNA dans les tissus situés autour de la zone agro-infectée, sans pour autant conduire à la mise en place d'un signal systémique permettant au mécanisme d'extinction de se propager dans l'organisme. Sur la base de ces résultats, une série d'expériences a été initié dans le tabac pour identifier les conditions nécessaires à la mise en place d'un tel signal systémique, et développer un nouveau protocole d'agro-infection des plantes d'intérêt