Mécanisme de translocation de la toxine diphtérique

par Anne Chassaing

Thèse de doctorat en Biochimie. Biophysique

Sous la direction de Daniel Gillet.

Soutenue en 2008

à Paris, Muséum national d'histoire naturelle , dans le cadre de École doctorale Sciences de la nature et de l'Homme - Évolution et écologie (Paris) .

Le président du jury était Max Goyffon.

Le jury était composé de Vincent Forge.

Les rapporteurs étaient Bruno Beaumelle, Ina Attree-Delic.

mots clés

• Toxines diphtériques
• Translocation (génétique)

Résumé

La toxine diphtérique (DT) une toxine bactérienne sécrétée par Corynebacterium diphtheriae. Lors de l’intoxication d’une cellule, le domaine de translocation (T) de la DT s’insère dans la membrane à pH acide et assiste la translocation du domaine catalytique (C) dans le cytosol. Le domaine T adopte une conformation en molten globule (MG) et devient compétent pour l’interaction membranaire. Nous avons identifié par mutagenèse les résidus du domaine T dont la protonation favorise la formation de l’état MG en solution et l’interaction membranaire. Les résultats montrent que la protonation concertée des six histidines du domaine T est impliquée dans la formation de l’état MG en solution. La paire His223-257 et l’His251 ont un effet prépondérant dans la formation de l’état molten globule en solution, alors que la paire His322-323 (mais également His251) est davantage impliquée dans l’interaction avec la membrane, et en particulier la liaison à la membrane. Nous avons étudié les changements de conformation des deux domaines C et T dans une protéine CT correspondant à la DT tronquée de son domaine R, afin de comprendre les effets du lien covalent sur les conformations respectives de C et T en fonction du pH. Les mutants CTW50/153F et CTW206/281F ont permis de suivre la fluorescence des Trp de chaque domaine dans la protéine CT. Les résultats montrent que le domaine T dirige la translocation de C dans les premières étapes de la translocation (formation de l’état MG, liaison et insertion membranaire), et qu’il pourrait jouer un rôle de chaperon en stabilisant l’état MG du domaine C.

Résumé

Diphtheria toxin (DT) is a bacterial toxin with intracellular target, secreted by Corynebacterium diphtheriae. During cell intoxication, the translocation domain of DT (T) inserts into the endosomal membrane under acidic conditions and assists the translocation of the catalytic (C) domain in the cytosol. T undergoes conformational changes and adopts a molten globule (MG) state, competent for the interaction with the membrane. We first identified by mutagenesis the residues in the T domain whose protonation triggers the formation of the MG state in solution and the interaction with the membrane. The results showed that the concerted protonation of the six histidines in the T domain is implicated. We found that the pair His223-257 et His251 are more implicated in the formation of the MG state in solution and that the pair His322-323 (and His251) is more implicated in the interaction with the membrane. We then studied the conformational changes of both C and T domains within a CT protein corresponding to the whole toxin truncated at the R domain to understand the effects of the covalent link between the two domains on the conformations of C and T as a function of pH. We produced two Trp mutants, CTW50/153F and CTW206/281F, that allow to follow up the Trp fluorescence of each domain in the CT protein. The results showed that the T domain leads the way in the first steps of translocation (MG formation, binding and membrane insertion), and that it may play the role of a membrane chaperone by stabilizing the MG state of C.