Développement de nouvelles stratégies de chimie bio-orthogonales pour la protéomique : application à l’étude de la O-N-acétyl glucosaminylation des protéines

Development of a new strategy based on chemical tagging using click chemistry for the detection and identification of O-GlcNAc modified proteins

• Auteur / Autrice : Caroline Gurcel
• Direction : Jérôme Lemoine
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Chimie analytique
• Date : Soutenance en 2008
• Etablissement(s) : Lyon 1

Mots clés

Mots clés contrôlés

Protéomique

Résumé

La O-N-acétyl glucosaminylation (O-GlcNAc) des protéines est une modification post-traductionnelle dynamique affectant les protéines nucléo-cytoplasmiques. Elle intervient notamment dans l’activité protéique et des pathologies comme le diabète voient des altérations de la distribution de cette glycosylation. Une détection et une identification spécifiques des protéines O-GlcNAc seraient d’un grand intérêt pour mieux comprendre cette modification. Nous avons mis au point un outil protéomique permettant de détecter et d’enrichir les protéines portant un groupement O-GlcNAc, basé sur une approche chimique bio-orthogonale par la réaction 1,3-dipolaire de Huisgen, aussi appelée click chemistry. Cette réaction, effectuée entre une fonction azido et un alcyne terminal, est compatible avec les milieux biologiques ; de plus, les groupements chimiques intervenant sont inertes vis-à-vis des fonctions du vivant. Lorsque la réaction est réalisée en conditions physiologiques, elle permet un étiquetage hautement spécifique de protéines O-GlcNAc grâce à l’incorporation métabolique d’un analogue azido de la glucosamine pouvant réagir avec des sondes portant la fonction alcyne. Cette méthode a permis la détection et l’identification de protéines O-GlcNAc en utilisant un système par affinité (biotine/streptavidine) suivi par une analyse par spectrométrie de masse. Cette stratégie a été améliorée en se basant sur un système impliquant des liaisons covalentes et clivables par irradiation UV ; elle vise à localiser les sites de modifications en purifiant des protéines et des peptides O-GlcNAc sur une phase solide portant la sonde photoclivable

The O-linked-N-acetylglucosamine (O-GlcNAc) modification is an abundant post-translational modification in eukaryotic cells. This dynamic glycosylation plays a fundamental role in the activity of many nuclear and cytoplasmic proteins and is associated with pathologies like type II diabetes, Alzheimer’s disease or some cancers. However the exact link existing between O-GlcNAc modified proteins and their function in cells is largely undefined for most of them. We have developed a strategy based on a chemical approach using the 1,3-dipolar cycloaddition, called commonly click chemistry, to specifically tag O-GlcNAc modified proteins. This reaction is performed between an azido and an alkyne functions and is compatible with physiological conditions. An unnatural N-acetylglucosamine (GlcNAc) analogue (substituted with an azido or an alkyne group) is metabolized by the cell and can react with the corresponding biotinylated probe to specifically detect, enrich and identify O-GlcNAc modified proteins. Thanks to this method, the detection and the identification of some O-GlcNAc modified proteins had been successfully realised using the affinity couple biotin/streptavidin, followed by an analysis by mass spectrometry. Another system, which implied covalent and cleavable bindings by exposure to UV light, was then developed in order to localize the specific sites of O-GlcNAc modification on proteins. This work illustrates the interest of the click chemistry-based strategy combined with a proteomic approach to get further insight into the pattern of O-GlcNAc modified proteins and the biological significance of this post-translational modification