Approches de glycomique appliquées à l'étude des pathologies métaboliques des glycoprotéines

Glycomic approaches applied to study of metabolic disorders of glycoproteins

• Auteur / Autrice : Valegh Faid
• Direction : Willy Morelle, Jean-Claude Michalski
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences de la vie et de la santé
• Date : Soutenance le 10/04/2008
• Etablissement(s) : Lille 1
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Biologie-Santé (Lille ; 2000-....)

Mots clés

Mots clés contrôlés

Dissertation universitaire

Spectrométrie de masse MALDI

Acides sialiques

Mannosidose

Maladies lysosomiales congénitales

Marqueurs biologiques

Oligosaccharides

Maladies

Glycosylation

Troubles du métabolisme

Glycoprotéines

Mots clés libres

Glycomique

Glycannes

Glycoprotéinoses

Résumé

Les glycannes des glycoprotéines sont impliqués dans de multiples processus biologiques, tels que l'inflammation, l'immunité, le développement et la reproduction. Ils sont responsables des nombreuses propriétés physicochimiques, immunologiques et biologiques des glycoprotéines. Ils peuvent, de fait, moduler les propriétés pharmacologiques des glycoprotéines recombinantes thérapeutiques. Leur importance a également été démontrée par la sévérité des présentations cliniques et les taux de morbidité / mortalité de CDG. Cependant, la médecine moderne manque cruellement d'outils glycobioanalytiques permettant l'exploration de ces métabolismes, à grand échelle. Les objectifs de notre thèse étaient donc fondés sur la mise au point d'approches et d'outils glycobioanalytiques, basés sur l'utilisation de la spectrométrie de masse appliqués à l'étude de la glycosylation d'une glycoprotéine d'intérêts biologiques, l'a-mannosidase lysosomale (LAMAN), et à l'étude de fluides biologiques d'intérêts, tels que le plasma sanguin et l'urine, qui regorgent de précieux glycobiomarqueurs diagnostiques et/ou pronostiques spécifiques, formés au cours de pathologie congénitales de la biosynthèse (CDG) et du catabolisme (glycoprotéinoses) des glycoprotéines. La première partie de notre travail de thèse a consisté en la caractérisation structurale de la glycosylation de la LAMAN bovine, qui constitue notre modèle d'étude de la LAMAN humaine et de la pathogénése moléculaire de l'a-mannosidose. Nous avons pu déterminer la structure détaillée d'une vingtaine de N-glycannes ainsi que leur positions sur six des huit sites de glycosylation de la LAMAN bovine. Les résultats obtenus constituent un base solide pour l'étude de la glycosylation de la LAMAN humaine recombinante, dédiée à l'évaluation de son efficacité thérapeutique dans le traitement expérimental de l'a-mannosidose. La seconde partie de notre travail de thèse a consisté en la mise au point de méthodologies de glycomique dédiées au profilage et à la caractérisation structurale de glycobiomarqueurs urinaires diagnostiques des glycoprotéinoses. Dans un premier temps, nous décrivons une méthode de profilage complet des oligosaccharides et de glycoasparagines urinaires perméthylés, par MALOI-TOF-MS, reflets du catabolisme Iysosomal de glycoprotéines cellulaires, par la microanalyse de 20 µL d'urine de patients. Dans un second temps, appliquée, à l'étude des oligosaccharides urinaires d'un patient atteint d'une ß-mannosidose, nous avons pu identifier et partiellement caractériser neuf nouvelles structures, jamais décrites chez l'homme. Enfin, la dernière partie de notre travail de thèse a consisté en la mise au point d'une approche glycobioanalytique globale permettant d'explorer les processus de g!ycosylation des protéines. Dans cette étude, nous décrivons une méthode de profilage rapide du N- et du O-glycome des glycoprotéines sériques totales par MALOI-TOF-MS, par la microanalyse de 30 µL de sérum, permettant la détection et la caractérisation de glycofonnes anormales, formées au cours des CDG. Appliquées au sérum de patients souffrant de CDG-lla et d'une déficience en protéine COG 1, cette stratégie a permis de mettre en évidence et de caractériser de précieux glycobiomarqueurs diagnostiques de ces maladies

Glycoprotein-derived glycans are involved in numerous biological processes , such as inflammation, immunity. development and reproduction. They are responsible for numerrous physicochemical, immunological and biological properties of glycoproteins, and, they can modulate the pharmacological properties of therapeutic recombinant glycoproteins. Their importance has been demonstrated by the severity of the clinical pictures and the high level of morbidity and mortality of patients suffering from congenital disorders of glycosylatlon (COG). Therefore, in the field of clinical chemistry, there is a lack of glycobioanalytica! tools for the exploration of the glycoprotein-derived glycan metabolism. Then, the objectives of our thesis was founded on the development of glycobioanalytical approaches, relied on mass spectrometry, applied to the study of the glycosylation of biologically interesting glycoproteins, such as LAMAN, or biological fluids, such as blood plasma and urine, known to contain numerous specific diagnostic and/or prognostic glycobiomarkers, yielded during congenital defect in the biosynthesis (CDG) and in the catabolism (glycoproteinoses) of glycoprotein-derived glycans. The first step of our thesis consisted in the site-specifie glycosylation analysis of bovine LAMAN, whlch constltutes our model of study of the human enzyme and of the molecular pathogenesis of a-mannosidosis. The detailed structures as well as their distribution within six of eight glycosy!ation:sites were determined. These results constitute a solid basis of work for the site-specific glycosylation analysis of the human recombinant LAMAN, in order to evaluate its therapeutic efficiency in the experimental treatment of a-mannosidosis. The second step of our thesis consisted in the elaboration of mass spectrometry methodologies for the profiling as well as the structural characterization of ths urinary oligosaccharides an glycoasparagmes, as valuable glycoprotemoses-assoclated glycobiomarkers. Applled to the mass profilinïg of urinary oligosaccharides of a patient suffering from ß-mannosidosis, nine new structures, never described in man, were identified and partially characterized. Finally, the last part of our thesis consisted in the elaboration of a global glycobloanalytlcal methodology, enablrng the exploratIon of g/ycosylation prccesses of cellular proteins. ln this study we described a.rapid mass spectrometric strategy for the structural characterization of N- and O-glycan chams ln the dlagnosis of genetlc defects in glycan blosynthesis. Applied to patients suffering from CDG-lla and CDG-llg ,valuable diagnostic glycobiomarkers were identified.