Ingénierie du système d’expression Yarrowia lipolytica pour l’évolution dirigée et l’étude structurale de la lipase Lip2 de Yarrowia lipolytica

Engineering Yarrowia lipolytica expression system for directed evolution and structural studies of the Lip2 lipase from Yarrowia lipolytica

• Auteur / Autrice : Florence Bordes
• Direction : Alain Marty
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Microbiologie et biocatalyse industrielle
• Date : Soutenance en 2008
• Etablissement(s) : Toulouse, INSA

Mots clés

Mots clés contrôlés

Radiocristallographie

Mutagenèse

Yarrowia lipolytica

Lipases

Mots clés libres

Lipase

Yarrowia lipolytica

évolution dirigée

Système d’expression

Mutagenèse

Criblage à haut-débit

Thermostabilité

Agrégation

études cristallographiques

Modélisation moléculaire

Résumé

La lipase Lip2 de Y. Lipolytica est un biocatalyseur prometteur d’un point de vue biotechnologique. Elle est déjà utilisée dans l’industrie pour sa capacité à hydrolyser les lipides et présente d’autre part une sélectivité intéressante envers différents types de substrats (résolution de mélanges racémiques, ester de DHA, …). Cependant, du fait de sa faible thermostabilité et d’une sélectivité encore insuffisante, les applications industrielles ne sont pas encore développées pour ses capacités de bioconversion à forte valeur ajoutée. Dans le but d’améliorer les propriétés de cette lipase, nous avons développé au cours de ce travail de thèse deux outils permettant de faire évoluer ce biocatalyseur d’intérêt par évolution dirigée d’une part et par évolution rationnelle d’autre part. La première partie de la thèse a donc consisté à mettre au point un système d’expression pour le criblage haut débit d’activités enzymatiques chez la levure Yarrowia lipolytica. Le principal apport réside dans la construction de la souche JMY1212, qui contient une plate-forme d’intégration génomique où la cassette d’expression va s’intégrer de manière ciblée. Ainsi, les taux de transformation, le niveau d’expression, et la répétabilité du système ont été rendus compatibles avec le criblage haut-débit. La reproductibilité du système a également été assurée par l’utilisation d’outils robotisés et l’optimisation de la croissance et de l’expression protéique en microplaque. Ces travaux ont permis d’obtenir le premier système d’expression eucaryote dédié à l’évolution dirigée d’enzymes. Ce système d’expression a été utilisé pour construire une banque de variants de la lipase Lip2. Un crible sur la thermostabilité a permis d’obtenir un variant de thermostabilité améliorée. Les temps de demi-vie ont été améliorés d’un facteur 21 à 127 selon les températures. Cette caractérisation a permis de mettre en évidence que l’agrégation de l’enzyme et l’interchange des ponts disulfures étaient les principaux mécanismes impliqués dans la dénaturation thermique de Lip2. L’étude des relations structure-fonction d’une enzyme passe par la connaissance de sa structure. Des essais de cristallisation de l’enzyme ont donc été initiés. L’obtention de cristaux utilisables pour la détermination de la structure 3D a nécessité la déglycosylation de l’enzyme par voie enzymatique. Plusieurs conditions de cristallisation ont été obtenues. L’une d’entre elle a permis l’enregistrement d’un jeu de données à 1,7 Å. Différentes méthodes pour recouvrer l’information de phase ont été expérimentées. Le phasage des données par remplacement moléculaire n’a pas permis de donner de solution. Les techniques de phasage ab initio (remplacement isomorphe ou MAD) sont en cours ; à ce jour cependant aucun des métaux lourds testés n’est fixé dans l’édifice cristallin. La méthode de bioincorporation de sélénométhionines directement dans la lipase, qui paraît la plus prometteuse, a été initiée. Ce type de production n’a encore jamais été réalisé chez Y. Lipolytica et les premiers résultats, bien qu’encourageants, demandent encore des mises au point. Par ailleurs, un modèle de la structure 3D a pu être généré par homologie avec des enzymes de structure tridimensionnelle connue. Celui-ci a permis de cibler avec succès des acides aminés à modifier pour améliorer la résolution de mélanges racémiques d’intérêt pharmaceutiques.

Yarrowia lipolytica Lip 2 lipase is a promising lipase from a biotechnological point of view. It has already been used in industrial applications for its ability to hydrolyse lipids and because of its interesting selectivity towards different types of substrates (racemic mixtures resolution, DHA ester, … ). However, the low thermostability and insufficient selectivity of this enzyme have prevented the development of industrial applications for high value added bioconversion products. In order to improve its properties, we have followed a double approach to engineer this enzyme using directed evolution and rational design. The first part of the work describes the set up of an expression system for the high throughput screening of enzymatic activities in the yeast Yarrowia lipolytica. The main novelty of this method lies in the use of JMY1212 strain which was constructed on purpose. It contains a genomic docking platform, in which the insertion of the expression cassette was done in a targeted way. Thus, transformation efficiency, expression level, and reproductibility of the full process were then compatible with high-throughput screening in the yeast Yarrowia lipolytica. Furthermore, the reproducibily of the full process was ensured by using robots and optimizing growth and protein expression in 96-well microplates. This work led to the obtention of the first eukaryotic expression system devoted to directed evolution. This expression system was used to create a library of Lip2 variants which was subsequently screened on thermostability to isolate a variant with improved thermostability. Mutant’s half-lives were 21 to 127 times higher than wild type lipase depending on the temperature. The characterisation of this variant required the optimisation of the expression system and the set up of the lipase purification method. The variant characterisation permitted to reveal that aggregation and disulfide interchange were the main mechanisms involved in Lip 2 thermal denaturation. To gain a deeper insight of structure-activity relationships, crystallographic studies have been undertaken. Crystallisation trials have been set up using the deglycosylated enzyme. Crystals obtained led the recording of a 1. 7 Å data set. Different methods have been attempted to retrieve the phase information without success. Data phasing by molecular replacement failed to resolve the structure. Although ab initio phasing by isomorphous replacement is still in progress, none of the heavy metals tested has been fixed in crystals to date. The method of selenomethionine bio-incorporation directly into the lipase for Multiple Anomalous Diffraction (MAD) phasing, has been initiated. This kind of production in Y. Lipolytica has never been reported yet. It gave some promising preliminary results although, it still requires adjustments. A 3D model of Lip2 has also been generated by homology with enzymes of known structure. This model allowed the identification of amino acids which were changed sucessfully to improve the racemic resolution of important class of pharmaceuticals