Recherche Avancée

Thèse soutenue

Polymère à empreintes moléculaires comme élément de reconnaissance dans un biocapteur

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Auteur / Autrice : Magali Bartkowski
Direction : Karsten Haupt, Karim El Kirat-Chatel
Type : Thèse de doctorat
Discipline(s) : Biotechnologie
Date : Soutenance en 2008
Etablissement(s) : Compiègne

Résumé

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Cette thèse de doctorat s'intègre dans un projet de recherche en collaboration avec deux autres partenaires, l'INERIS et l'UMR CNRS 6600, financé par le Conseil Régional de Picardie. Ce projet vise à développer, pour des études de toxicité de molécules chimiques, un système in vitro basé sur la culture cellulaire dans une puce microfluidique. Ce système permettra de reproduire de façon la plus proche possible un système biologique. Le projet développé vise à proposer un système in vitro, permettant de reproduire de façon la plus proche possible le système biologique à petite échelle. Sous forme de chambre de culture microfluidique, il aura pour mission de permettre la croissance et la multiplication de plusieurs types de cellules représentant le système biologique entier, en créant un micro-environnement dynamique qui se rapproche des conditions de flux sanguin. Ce système pourra être utilisé pour des tests de toxicologie, si après injection de produits à tester à différentes concentrations, une réponse des cellules peut être détectée. Notamment, lorsque la dose de produit est toxique, la cellule meurt, libérant son contenu dans le liquide qui circule. Il suffira donc de placer en aval un biocapteur permettant de détecter les substances caractéristiques de la mort cellulaire. Un biocapteur est constitué d’un élément de reconnaissance (anticorps, enzyme, récepteur, ADN), qui adsorbe sélectivement l’analyte cible en question, et qui en contact avec un transducteur qui traduit le signal chimique ou physique obtenu en un signal facilement quantifiable. Le but de cette thèse, et notre contribution au projet global, était de développer un tel biocapteur, ce qui représentait un réel défi scientifique et technologique. L’un des facteurs limitant était le fait qu’un système cellulaire est susceptible de libérer des enzymes hydrolytiques capables de dégrader les biomolécules utilisées comme éléments de reconnaissance, à l’état vivant mais encore davantage après la mort cellulaire. Pour cela, nous nous sommes tournés vers des récepteurs synthétiques à base de polymères à empreintes moléculaires. Ces matériaux ne sont à priori pas biodégradables et présentent de toute façon une plus grande stabilité chimique et physique comparé aux biomolécules. Le système microfluidique pourra être ainsi facilement régénéré et stabilisé, ce qui est primordial pour une application en culture cellulaire. Comme molécule cible nous avons dans un premier temps sélectionné le cytochrome c, petite protéine intracellulaire qui est l’une des premières protéines relarguées lors de la mort cellulaire. Ceci représente également un défi car la technique de l’impression moléculaire, appliquée de façon quasi-routinière aux petites molécules, est à l’heure actuelle beaucoup moins développée pour les protéines. Pour être intégrer dans un système microfluidique, le polymère devait être obtenu sous forme d’un film mince, et afin d’éviter des temps de réponse trop longs, les sites de reconnaissance pour la cible doivent être facilement accessibles. Nous avons sélectionné comme méthodes de caractérisation du film l’AFM pour des études de morphologie, et la fluorescence pour mesurer la reconnaissance et l’adsorption de la cible. De plus, nous avons employé, pour la première fois, la spectroscopie de force par AFM, pour mesurer la force d’interaction entre la cible et son site de reconnaissance dans le film de polymère à empreinte moléculaire à l’échelle d’une molécule, et ainsi apporter une preuve directe de l’existence de ces sites. Dans la première partie de ce mémoire, nous nous attacherons à faire un rappel du contexte bibliographique de l’impression moléculaire, et nous présenterons les différentes méthodes de synthèse et les différentes applications de ces matériaux. Puis nous parlerons spécifiquement des difficultés pouvant être rencontrées lors de l’impression moléculaire de protéines, et des possibles solutions. Enfin, nous expliquerons la méthode de la microscopie à force atomique en détaillant notamment l’approche spectroscopie de force. Dans la deuxième partie, nous présenterons et discuterons les stratégies et les différents travaux réalisés pour obtenir et caractériser un polymère à empreinte moléculaire pour le cytochrome c.